富马酸二甲酯抑制和保护恶性黑色素瘤细胞的双重作用以及干预机制的研究

发布时间：2017-07-04 13:07

  本文关键词：富马酸二甲酯抑制和保护恶性黑色素瘤细胞的双重作用以及干预机制的研究

  更多相关文章： 黑色素瘤 DMF 细胞增殖 细胞凋亡 p62 Nrf2 自噬

【摘要】：目的:研究富马酸二甲酯(Dimethyl Fumarate,DMF)抑制与保护人恶性黑色素瘤细胞的双重作用,探讨增强DMF抗肿瘤效果的方法与机制。方法:应用MTT法与克隆形成实验检测不同浓度DMF对A375细胞增殖的影响。细胞分别经DNA染色,AnnexinV/PI染色或CMFDA标记后,通过流式细胞仪检测细胞周期分布,细胞凋亡率以及细胞内谷胱甘肽水平。用Western blot技术与q-PCR技术分别检测自噬与凋亡相关的蛋白和mRNA表达水平,并用免疫荧光染色技术观察DMF处理后细胞自噬的形态特征。应用双荧光素酶报告基因技术检测DMF对Nrf2信号通路的调节作用,并通过SiRNA转染沉默Nrf2和p62蛋白表达,然后通过流式细胞术检测检测DMF对肿瘤细胞凋亡的影响。结果:DMF在25-100μmol/L浓度范围内可明显地抑制A375肿瘤细胞的增殖。当浓度达到50μmol/L时,肿瘤细胞几乎完全失去克隆形成能力。细胞周期结果显示,低剂量DMF(50μmol/L)导致S期细胞减少50%,高剂量DMF(100μmol/L)则导致显著的G2/M期细胞阻滞。DMF在25-100μmol/L浓度范围内可以剂量依赖方式诱导细胞凋亡增加,并伴随着Caspase-3活化和PARP-1蛋白裂解。DMF导致A375细胞谷胱甘肽(GSH)水平降低,用氧自由基抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞,能逆转DMF诱导的细胞周期改变。DMF也通过激活Nrf2信号通路和增强细胞自噬诱导A375肿瘤细胞产生保护反应。DMF处理导致Nrf2报告基因活性增强,并伴有靶基因HO-1,NQO-1转录增加。DMF同步上调p62和Nrf2的蛋白与mRNA水平,提示二者形成正反馈环路。DMF处理的细胞表现出自噬增强的特征,表现为LC3-II蛋白转化增加,LC3免疫荧光染色呈点状分布并与溶酶体标记蛋白LAMP-1重合,这提示自噬溶酶体形成。用特异的SiRNA沉默Nrf2,可明显增加DMF诱导A375细胞凋亡的能力。结论:DMF可显著地抑制人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖与克隆形成,诱导细胞凋亡。另外DMF也通过诱导细胞自噬和激活Nrf2信号通路使肿瘤细胞产生药物抵抗。抑制Nrf2信号通路可增强DMF对肿瘤细胞的杀伤作用。
【关键词】：黑色素瘤 DMF 细胞增殖 细胞凋亡 p62 Nrf2 自噬
【学位授予单位】：大连大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文献综述12-19
• 1.1 富马酸二甲酯及其主要的药理作用12-13
• 1.2 DMF用于肿瘤治疗的研究13-18
• 1.2.1 DMF的抗肿瘤作用机制13-14
• 1.2.1.1 干扰肿瘤细胞的氧化还原状态13-14
• 1.2.1.2 DMF显著抑制NF kappa B的活性14
• 1.2.1.3 DMF抑制肿瘤血管新生14
• 1.2.1.4 DMF抑制肿瘤细胞侵袭与转移14
• 1.2.2 DMF的保护肿瘤作用机制14-18
• 1.2.2.1 激活Nrf2信号通路14-17
• 1.2.2.2 调节细胞自噬功能17-18
• 1.3 结束语18-19
• 2 DMF对恶性黑色素瘤细胞的抗肿瘤作用研究19-40
• 2.1 引言19
• 2.2 实验材料19-24
• 2.2.1 实验细胞19
• 2.2.2 主要器材19-20
• 2.2.3 主要试剂20-22
• 2.2.4 试剂的配制22-24
• 2.3 实验方法24-28
• 2.3.1 细胞培养24
• 2.3.2 MTT实验24-25
• 2.3.3 克隆形成实验25
• 2.3.4 细胞周期分析25
• 2.3.5 细胞凋亡检测25-26
• 2.3.6 谷胱甘肽水平的检测26
• 2.3.7 细胞总蛋白的提取与定量26
• 2.3.8 免疫印迹检测蛋白表达水平26-28
• 2.3.9 统计学处理28
• 2.4 实验结果28-38
• 2.4.1 DMF抑制A375细胞增殖和克隆形成28-30
• 2.4.2 DMF诱导A375细胞发生G2期和有丝分裂期阻滞30-32
• 2.4.3 DMF处理诱导A375细胞凋亡32-33
• 2.4.4 DMF降低细胞内谷胱甘肽水平33-35
• 2.4.5 GSH水平对DMF诱导细胞周期改变的重要性大于细胞死亡35-38
• 2.5 讨论38-39
• 2.6 小结39-40
• 3 DMF诱导恶性黑色素瘤细胞产生药物抵抗的研究40-53
• 3.1 引言40-43
• 3.1.1 实验细胞40
• 3.1.2 主要器材40-41
• 3.1.3 主要试剂41-42
• 3.1.4 试剂的配制42-43
• 3.2 实验方法43-47
• 3.2.1 细胞培养43
• 3.2.2 免疫印迹检测蛋白表达水平43
• 3.2.3 细胞总RNA的提取与定量43-44
• 3.2.4 多聚酶链式反应44-45
• 3.2.4.1 第一链cDNA的合成44
• 3.2.4.2 PCR扩增44
• 3.2.4.3 PCR产物的鉴定44-45
• 3.2.5 实时定量PCR45
• 3.2.6 免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察45-46
• 3.2.7 双荧光素酶报告基因实验46-47
• 3.2.8 统计学处理47
• 3.3 实验结果47-51
• 3.3.1 DMF增强A375细胞的自噬功能47-49
• 3.3.2 DMF激活Nrf2介导的信号系统49-50
• 3.3.3 DMF诱导A375细胞形成p62-Nrf2正反馈信号环路50-51
• 3.4 讨论51-52
• 3.5 小结52-53
• 4 干预Nrf2信号通路增强DMF杀伤肿瘤细胞的研究53-60
• 4.1 引言53
• 4.2 实验材料53-55
• 4.2.1 实验细胞53
• 4.2.2 主要器材53-54
• 4.2.3 主要试剂54
• 4.2.4 试剂的配制54-55
• 4.3 实验方法55-56
• 4.3.1 细胞培养55
• 4.3.2 SiRNA法沉默基因Nrf2与p6255-56
• 4.3.3 基因沉默效果的鉴定56
• 4.3.3.1 多聚酶链式反应（PCR法）56
• 4.3.3.2 免疫印迹法56
• 4.3.4 细胞凋亡检测56
• 4.3.5 统计学处理56
• 4.4 实验结果56-59
• 4.4.1 SiRNA转染沉默Nrf2与p62基因表达56-57
• 4.4.2 沉默Nrf2增强DMF诱导的细胞凋亡57-59
• 4.5 讨论59
• 4.6 小结59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-67
• 附录A 附录缩略语67-68
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况68-69
• 致谢69-70

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