无义突变RB1和MEN1抑癌基因的翻译调控及通读研究

发布时间：2017-07-05 04:12

  本文关键词：无义突变RB1和MEN1抑癌基因的翻译调控及通读研究

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【摘要】：基因的无义突变在细胞内产生了含有提前终止密码子(premature translation termination codon, PTC)的异常mRNA。这些含有PTC的mRNA在第一轮翻译过程中被细胞内的无义突变介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)所识别和降解,从而消除这种mRNA翻译产生的截短的、有毒的蛋白质对机体的危害。NMD途径是一种重要的真核生物基因转录后监督机制,是基因表达的翻译调控(translation control)。研究发现,许多癌症和肿瘤的致病原因是由于无义突变导致抑癌基因表达水平严重降低或缺失。因此,抑癌基因无义突变及其翻译调控的研究,有助于揭示基因突变引发癌症的发病机制。成视网膜细胞瘤(retinoblastoma, RB)是婴幼儿眼内恶性肿瘤中最常见的一种。1971年,Kundson等人鉴定出了该疾病的致病基因RB1,研究发现该肿瘤的形成是由于第13号染色体(13q14)上一对等位基因的同时缺失或失活导致的,表明该基因具有抑制肿瘤形成的作用,并首次提出了肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)的概念。RBGMdb数据库(http://rb 1-1sdb.d-lohmann.de/)显示,所有由RB1基因突变引起的成视网膜细胞瘤病例中,无义突变占到了42.4%。本研究第一部分以RB1基因作为研究对象,探讨无义突变RB1基因的表达调控机制。首先,构建了mini-RB1小基因,包括外显子1～14(cDNA)、内含子14-外显子15-内含子15和外显子16～27(cDNA)三部分序列,将其克隆到真核表达载体pCMV-MH中。根据人类基因组突变数据库,选择3个RB1基因的无义突变位点W99X、G310X和R467X,并构建相应的无义突变体。分别将mini-RBI基因野生型和无义突变体转入HeLa细胞中进行表达。qRT-PCR分析结果显示,3个无义突变体与野生型相比mRNA水平均无显著差异,表明无义突变体mini-RB1可能发生了NMD逃逸现象。为了进一步证实以上结果,我们利用NMD抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D,分别处理转入野生型mini-RB1基因及其无义突变体W99X和G310X的哺乳动物细胞,发现处理前后的mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异,进一步说明含有W99X或G310X无义突变的mini-RBI基因的mRNA的确发生了NMD逃逸。Western blot分析mini-RB1基因的蛋白质表达水平,发现在无义突变位点W99X和G310X下游重新起始了蛋白质的翻译。由此,我们认为PTC下游翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因之一。对于基因无义突变导致的遗传性疾病(例如,囊性纤维化、血友病等)和肿瘤的治疗研究,主要集中于基因通读药物,如氨基糖甙类药物和小分子化合物PTC124,以及临床药物,如Amlexanox(用于口腔溃疡的治疗)。药物处理后在细胞或机体中能够检测到全长目的蛋白质表达量的提高。通读药物在一定程度上可以缓解疾病的临床症状。但由于NMD途径的监控,细胞内无义突变基因产生的mRNA被降解,作为通读药物的底物,由于含量很低,使全长蛋白质的表达量受到限制。本研究的第二部分主要以受NMD途径调控的MEN1(多发性内分泌腺瘤Ⅰ型)基因为研究对象,研究NMD途径抑制药物和通读药物的联合作用对有效提高全长Menin蛋白表达水平的协同作用。首先,我们将含有MEN1小基因及其无义突变体M1(Q141X),M2(Y312X),M3(Y312X)和M4(Y417X)的质粒转入HeLa细胞中,然后用不同浓度的通读药物PTC124(0,2,10,20μM)和Amlexanox(0,5,10,100μ.M)处理细胞,通过Western blot检测两种药物对4个无义突变体全长Menin蛋白表达的恢复效果。确定PTC124和Amlexanox的促通读作用的最适浓度分别为20μM和100μM。然后,分别用RNAi和microRNA方法抑制NMD途径,即用pSIR-UPF1和miR125a分别处理转染MEN1小基因及其无义突变体的HeLa细胞。Western blot分析发现,抑制NMD途径的同时用通读药物处理可以明显提高无义突变的MEN1基因在细胞中表达水平,产生的全长Menin蛋白的水平相对于未处理对照最高达10倍。qRT-PCR分析联合处理后细胞中无义突变MEN1基因的mRNA水平,发现两种NMD抑制药物均增加了mRNA水平,而通读药物PTC124一定程度降低了mRNA水平,Amlexanox增加了mRNA水平。两种药物联合处理后MEN1的mRNA水平均有相应的增加。综合以上结果,我们认为,NMD抑制药物和基因通读药物的联合作用,通过提高异常mRNA在细胞中的含量,增加了通读药物的作用底物,使得细胞中全长Menin蛋白质水平有明显提高。研究结果为无义突变导致的相关疾病的研究和临床治疗方案的制定提供了重要思路和基础数据。
【关键词】：RB1基因 MEN1基因 NMD途径 基因通读
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2;Q78
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 第一章 文献综述15-23
• 1.1 NMD途径15-18
• 1.1.1 NMD途径的分子机制15-16
• 1.1.2 NMD途径中的作用因子16
• 1.1.3 NMD逃逸(NMD-escape)和NMD不敏感(NMD-irrelevant)16-17
• 1.1.4 NMD途径与疾病17-18
• 1.2 RB1基因简介18-19
• 1.2.1 成视网膜细胞瘤疾病18
• 1.2.2 RB1基因18-19
• 1.3 MEN1基因简介19-20
• 1.3.1 多发性内分泌肿瘤Ⅰ型疾病19
• 1.3.2 MEN1基因19-20
• 1.4 通读药物简介20-21
• 1.4.1 无义突变基因的通读作用20-21
• 1.4.2 通读药物及其发展现状21
• 1.5 本课题的研究思路、目的和意义21-23
• 第二章 RB1小基因野生型及无义突变体的构建与表达23-35
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 实验细胞株、菌株和载体23
• 2.1.2 主要的酶与试剂23
• 2.1.3 主要试剂配制方法23-25
• 2.1.4 主要仪器25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 mini-RB1小基因的构建25-29
• 2.2.2 mini-RB1小基因无义突变体的构建29-30
• 2.2.3 哺乳动物细胞HEK-293T的培养及转染30-31
• 2.2.4 Western印迹检测mini-RB1小基因的表达31-32
• 2.3 实验结果32-33
• 2.3.1 mini-RB1基因的构建与表达32-33
• 2.3.2 mini-RB1基因无义突变体的构建33
• 2.4 讨论33-35
• 第三章 无义突变的RB1小基因的NMD逃逸35-42
• 3.1 实验材料35-36
• 3.1.1 实验细胞株和质粒35
• 3.1.2 主要的酶与试剂35
• 3.1.3 主要仪器35
• 3.1.4 主要试剂配制方法35-36
• 3.2 实验方法36-38
• 3.2.1 细胞中总RNA的提取36
• 3.2.2 去基因组反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)36-37
• 3.2.3 实时荧光定量PCR(quantify Real-Time PCR,qRT-PCR)37-38
• 3.2.4 Western Blot检测mini-RB1野生型与突变体蛋白质表达38
• 3.2.5 HeLa细胞培养及转染38
• 3.2.6 细胞的药物处理38
• 3.2.7 统计学分析38
• 3.3 实验结果38-41
• 3.3.1 mini-RB1基因无义突变体mRNA水平的测定38-39
• 3.3.2 mini-RB1基因无义突变体W99X和G310X发生NMD逃逸39
• 3.3.3 W99X和G310X无义突变体PTC下游翻译的重新起始39-41
• 3.4 讨论41-42
• 第四章 MEN1基因的通读药物研究42-55
• 4.1 实验材料42-44
• 4.1.1 实验细胞株与质粒42-43
• 4.1.2 主要试剂43
• 4.1.3 主要试剂配制方法43-44
• 4.2 实验方法44-47
• 4.2.1 不同浓度的通读药物处理HeLa细胞44
• 4.2.2 NMD途径抑制药物与通读药物联合处理HeLa细胞44-45
• 4.2.3 灰度扫描分析Western Blot结果45
• 4.2.4 含有MEN1基因野生型或无义突变体的HeLa细胞稳定株的构建45-46
• 4.2.5 qRT-PCR检测MEN1基因的mRNA水平46-47
• 4.2.6 qRT-PCR数据的统计学分析47
• 4.3 实验结果47-52
• 4.3.1 筛选通读药物PTC124和Amlexanox的最适浓度47
• 4.3.2 NMD抑制药物提高了通读药物对全长Menin蛋白表达的恢复作用47-49
• 4.3.3 含有MEN1基因野生型或无义突变体的HeLa细胞稳定株的构建49-51
• 4.3.4 NMD抑制药物和通读药物的联合处理对无义突变的MEN1基因mRNA水平的影响51-52
• 4.4 讨论52-55
• 总结与展望55-58
• 参考文献58-63
• 附录 略语表63-64
• 攻读学位期间取得的研究成果64-65
• 致谢65-67
• 个人简况及联系方式67-68
• 承诺书68-69

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 周勇;杨洁;李恒进;;早熟终止密码子通读治疗遗传性癌症综合征的研究进展[J];肿瘤预防与治疗;2014年02期

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本文编号：520464