人脐带间充质干细胞分泌的微囊通过ATM-p53途径抑制膀胱肿瘤生长的研究

发布时间：2017-07-05 07:11

  本文关键词：人脐带间充质干细胞分泌的微囊通过ATM-p53途径抑制膀胱肿瘤生长的研究

  更多相关文章： 微囊 ATM信号通路 G0/G1期阻滞 细胞凋亡

【摘要】：目的:膀胱癌是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一,多以移行细胞癌为主,临床上分为非肌层浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌,其中浸润性膀胱癌恶性程度较高、易转移,如治疗不及时,预后较差。之前的研究表明,来源于脐带间充质干细胞(human umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells,hWJMSCs)的微囊(microvesicles,MVs)可以有效的降低膀胱肿瘤细胞的浸润性并诱导肿瘤细胞凋亡。在其作用过程中,hWJMSC-MVs首先上调p53蛋白的表达量,随后激活的p53基因通过调控一系列下游靶点基因(p21、Caspase 3)来抑制膀胱肿瘤细胞的增殖。然而该信号通路的上游调控因子ATM(Ataxia telangiectasia mutatedkinase)的作用尚未明确。有研究表明,ATM低表达的肿瘤细胞接受射线、化学药物等处理更容易被诱导凋亡。因此,我们假设ATM的基础表达水平可以影响hWJMSC-MVs对膀胱肿瘤细胞的作用效果。本项目中,我们首先验证hWJMSC-MVs是否能对膀胱肿瘤的增殖产生抑制效果和ATM在h WJMSC-MVs作用中的表达情况,再通过ATM特异性抑制剂和激活剂改变ATM蛋白的表达水平,最后分析hWJMSC-MVs处理膀胱肿瘤细胞后肿瘤细胞周期停滞与凋亡指数的变化及ATM-p53-p21通路中主要靶点蛋白的活化、表达水平的改变。以此来探讨ATM对人脐带间充质干细胞微囊抑制膀胱肿瘤细胞生长的可能调控机制。这为将来临床上微囊治疗肿瘤奠定良好的实验基础。方法:1.采用MTT比色法检测不同浓度hWJMSC-MVs对不同的膀胱肿瘤细胞系的生长抑制。2.采用流式细胞仪技术来分析膀胱肿瘤细胞的细胞周期以及细胞凋亡量。3.在不同的作用条件下,采用Western blot来分析ATM,p-ATM,p53,p21,Bax和cleaved Caspase 3蛋白的表达水平。结果:1.在相同作用时间的条件下,随着hWJMSC-MVs浓度的增加,三种膀胱肿瘤细胞系的凋亡量也明显增加。其中T24细胞系最为敏感。2.hWJMSC-MVs可以通过激活ATM-p53信号通路导致G0/G1期的细胞周期阻滞。3.hWJMSC-MVs通过提高cleaved caspase 3和Bax凋亡蛋白的表达来引起T24细胞的凋亡。4.在hWJMSC-MVs的作用情况下,通过抑制ATM-p53信号通路来废除T24细胞G0/G1期的周期阻滞,进一步提高了hWJMSC-MVs对肿瘤细胞的凋亡作用。结论:通过本实验可以看出,在hWJMSC-MVs使用剂量增加的情况下,其对T24细胞的G0/G1期阻滞效果和诱导凋亡的效果也明显加强。本研究首次证明在hWJMSC-MVs作用下ATM-p53信号通路被激活,hWJMSC-MVs诱导上调了p-ATM、p53、p21、cleaved caspase 3和Bax蛋白水平从而对细胞周期及凋亡产生了影响。通过目前的研究,我们进一步的了解了有关膀胱肿瘤细胞G0/G1阻滞和细胞凋亡之间的相互作用关系,并证明了激活的ATM-p53信号通路对膀胱肿瘤细胞的存活是起到保护作用的。明确阐述了G0/G1期的细胞阻滞在膀胱癌的治疗过程中的潜在作用。我们的研究结果可以更好理解并处理这一复杂的治疗环境,在该治疗情况下,我们可以把hWJMSC-MVs正确与其他化疗药物组合,这样就使癌细胞应对hWJMSC-MVs作用时出现更有效的癌细胞特异性死亡。相信在不久的将来,来源于充质干细胞的微囊,可以变成一种新的抗癌药物来应用于临床。
【关键词】：微囊 ATM信号通路 G0/G1期阻滞 细胞凋亡
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-21
• 1. 实验材料14-16
• 1.1 膀胱肿瘤细胞系14
• 1.2 脐带标本14
• 1.3 细胞培养及实验试剂14-15
• 1.4 实验耗材和仪器15-16
• 2. 实验方法16-21
• 2.1 hWJMSCs的原代培养16
• 2.2 膀胱肿瘤细胞培养16-17
• 2.3 细胞传代17
• 2.4 hWJMSC-MVs制备17
• 2.5 hWJMSC-MVs透视电镜检测17-18
• 2.6 膀胱肿瘤细胞增殖活力检测（MTT法）18
• 2.7 膀胱肿瘤细胞周期检测18-19
• 2.8 膀胱肿瘤细胞凋亡检测19
• 2.9 Western blotting19-20
• 2.10 统计学方法20-21
• 结果21-26
• 1. h WJMSC-MVs分离及鉴定21
• 2. h WJMSC-MVs明显抑制膀胱肿瘤T24细胞增殖21-22
• 3. h WJMSC-MVs诱导T24细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡22-24
• 4. 抑制ATM-p53信号通路的表达，，可以提高hWJMSC-MVs对T24细胞的凋亡作用24-26
• 讨论26-29
• 结论29-30
• 参考文献30-34
• 综述34-43
• 参考文献38-43
• 临床病例报告43-46
• 参考文献45-46
• 致谢46-47

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本文编号：520960