DDX43促进AML形成作用及相关基因OCT4在AML中表达研究

发布时间：2017-07-05 06:28

  本文关键词：DDX43促进AML形成作用及相关基因OCT4在AML中表达研究

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【摘要】：目的:探索肿瘤/睾丸基因DDX43在急性髓系白血病(AML)中的致病机制。分析DDX43及OCT4等在AML细胞中的相关性,研究AML患者中OCT4的表达状况及临床相关性。方法:1.应用RQ-PCR技术检测OCT4基因的表达水平,并使用SPSS20.0软件对临床数据进行统计分析。2.构建DDX43过表达的HL60及SHI-1稳定细胞株,应用PQ-PCR以及Western Blot技术从m RNA及蛋白水平检测DDX43转染AML细胞中的表达情况。3.进行细胞生长实验、生存实验、周期实验、分化实验以及肿瘤球形成实验,观察DDX43转染细胞的增殖、生存及自我更新能力;DDX43转染细胞皮下接种裸鼠,记录裸鼠的体重及肿瘤体积变化;裸鼠处死后,用RQ-PCR及Western Blot技术检测裸鼠肿瘤中DDX43的表达状况。4.运用RQ-PCR技术检测DDX43转染细胞中OCT4、NANOG以及C-MYC的表达水平,另采用Western Blot技术检测DDX43转染细胞中C-MYC的表达状况。结果:1.OCT4在AML中的研究结果:(1)与对照组相比,AML患者的OCT4基因表达水平明显更高(P0.01)。OCT4的表达水平与患者的性别、年龄、外周血红蛋白、血小板计数均无明显的相关性(P0.05),但OCT4高表达组的患者比OCT4低表达组患者的白细胞计数要更高(P=0.001)。另外,M3患者OCT4的高表达率要明显低于其他类型的AML患者的OCT4高表达率(P=0.012)。(2)OCT4表达水平能够有效鉴别AML患者和对照组,AUC为0.915(95%的可信区间为0.837~0.992;P0.001)。当OCT4表达水平0.56时,其灵敏度和特异性分别为75.9%和81.2%。(3)高表达OCT4的患者和低表达OCT4的患者的完全缓解率不存在明显的差异(54%比65%,P0.05)。在所有年龄低于70岁的患者中,我们发现低OCT4表达患者比高OCT4表达的患者OS明显延长,且差异具有统计学意义(P=0.048)。2.DDX43在AML中的致病机制的研究成果:(1)DDX43转染细胞的DDX43表达量均明显高于对照组(P0.01)。(2)DDX43转染细胞生长速度均明显快于对照组(P0.01);DDX43转染细胞的生存率均明显高于对照组(P0.01);在HL60细胞中,DDX43组的细胞能够聚集形成较大肿瘤球,而对照组的细胞大多散在,不能成球;DDX43的肿瘤球形成率明显高于对照组(P0.05)。(3)DDX43转染细胞的周期实验和分化实验的结果与对照组相比无明显的差异(P0.05)。(4)DDX43组裸鼠的成瘤率明显高于对照组;DDX43组的肿瘤体积大于对照组,两者的差异具有统计学意义(P0.05);而且DDX43组的肿瘤的生长速度显著快于对照组,两组的差异具有统计学意义(P0.01)。DDX43组裸鼠肿瘤中DDX43含量明显高于对照组,两组的差异具有统计学意义(P0.01)。(5)在HL60细胞中,DDX43转染细胞中OCT4、NANOG、C-MYC的表达含量均显著高于对照组(P0.01),另外Western Blot也同样证实DDX43组的C-MYC的蛋白水平明显高于对照组。结论:1.OCT4在AML中表达水平明显升高,且OCT4基因可以作为AML预后不良的重要标志物;2.构建DDX43-HL60、Mock-HL60、DDX43-SHI-1、Mock-SHI-1细胞株;3.DDX43能够在体外促进AML细胞的增殖和生存,且能够促进AML细胞的自我更新;4.DDX43能够在体内促进AML细胞的肿瘤形成;5.DDX43可能通过介导肿瘤干细胞标志物OCT4、NANOG以及C-MYC从而促进肿瘤的发生发展。
【关键词】：OCT4 DDX43 急性髓系白血病 肿瘤干细胞 RQ-PCR
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 引言16-21
• 1.1 八聚体结合转录因子 4（octamer binding factor 4，，OCT4）16-17
• 1.2 DDX43（DEAD box polypeptide 43）17-19
• 1.3 急性髓系白血病（Acute myeloid leukaemia，AML）19-21
• 第一部分 OCT4在急性髓系白血病中表达的临床研究21-33
• 第一章 研究的目的、方法及实验方案的设计、意义21-23
• 1.1 研究背景及目的21-22
• 1.2 研究方法及技术22
• 1.2.1 实时定量PCR（RQ-PCR）22
• 1.3 实验方案22
• 1.4 研究的意义22-23
• 第二章 AML患者中OCT4表达的临床研究23-33
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 研究对象23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.1.3 主要仪器23-24
• 2.1.4 引物24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 单个核细胞提取和总RNA制备24-25
• 2.2.2 逆转录25
• 2.2.3 OCT4表达的RQ-PCR检测25
• 2.2.4 PCR产物纯化与回收25-26
• 2.2.5 重组载体构建26
• 2.2.6 重组质粒转化26
• 2.2.7 重组质粒提取及鉴定、测序26-27
• 2.2.8 阳性模板建立27
• 2.2.9 细胞遗传学检查27
• 2.2.10 统计学处理27-28
• 2.3 实验结果28-31
• 2.3.1 对照组中OCT4转录本水平28
• 2.3.2 AML患者中OCT4基因转录本水平28-30
• 2.3.3 OCT4基因表达具有辅助诊断标记意义30
• 2.3.4 OCT4表达与AML预后的关系30-31
• 2.4 讨论31-33
• 第二部分 DDX43在AML中的机制研究33-55
• 第一章 研究目的、方法及实验方案的设计、意义33-36
• 1.1 研究目的及背景33-34
• 1.2 实验方法与技术34
• 1.2.1 细胞培养技术34
• 1.2.2 蛋白印迹法（Western Blot）34
• 1.3 实验方案34-36
• 1.3.1 DDX43慢病毒载体构建及细胞转染35
• 1.3.2 体外实验35-36
• 1.3.3 体内动物实验36
• 1.3.4 机制研究36
• 1.4 研究的意义36
• 第二章 DDX43促进AML形成的机制研究36-55
• 2.1 实验材料36-39
• 2.1.1 细胞株36-37
• 2.1.2 实验动物37
• 2.1.3 引物37
• 2.1.4 主要试剂37-38
• 2.1.5 主要仪器38-39
• 2.2 实验方法39-46
• 2.2.1 细胞培养39
• 2.2.2 细胞的换液与传代39
• 2.2.3 细胞冻存39-40
• 2.2.4 RQ-PCR测定细胞株中DDX43的表达40
• 2.2.5 蛋白提取40-41
• 2.2.6 Western Blot测定细胞株中DDX43的表达41-43
• 2.2.7 生长实验43-44
• 2.2.8 生存实验44
• 2.2.9 周期实验44-45
• 2.2.10 分化实验45
• 2.2.11 肿瘤球形成实验45-46
• 2.2.12 裸鼠致瘤实验46
• 2.3 实验结果46-52
• 2.3.1 荧光下的DDX43细胞46
• 2.3.2 RQ-PCR检测DDX43在细胞株中的表达状况46-47
• 2.3.3 Western Blot检测DDX43在细胞株中的表达状况47
• 2.3.4 生长实验47-48
• 2.3.5 生存实验48
• 2.3.6 周期实验48-49
• 2.3.7 分化实验49-50
• 2.3.8 肿瘤球形成实验50
• 2.3.9 裸鼠致瘤实验50-51
• 2.3.10 裸鼠肿瘤中DDX43的表达状况51
• 2.3.11 机制研究51-52
• 2.4 讨论52-55
• 结论和展望55-56
• 1.1 主要结论55
• 1.2 展望55-56
• 参考文献56-66
• 致谢66-67
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及其他科研成果67

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