急性髓系白血病中AML1-ETO融合基因对SIRT1基因和EZH1基因表达调控的机理研究

发布时间：2017-07-06 16:23

  本文关键词：急性髓系白血病中AML1-ETO融合基因对SIRT1基因和EZH1基因表达调控的机理研究

  更多相关文章： AML1-ETO SIRT1 EZH1 表观遗传学 基因表达调控 荧光素酶报告基因 AML

【摘要】：目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia-AML)是一类克隆性侵袭性血液病,由髓系细胞分化凋亡障碍、增殖失控引起。t(8；21)(q22；q22)是AML中最常见的染色体异位,异位后形成新的融合基因AML1-ETO。AML1-ETO融合基因作用于其他基因,导致基因异常激活,引起表观遗传学改变,影响造血分化、增殖以及凋亡等方面功能,被认为是白血病的发病机制之一。表观遗传学改变包括了组蛋白的去乙酰化和组蛋白的甲基化,表观遗传学失调与血液系统疾病的发生发展密切相关。SIRT1基因产物具有去乙酰化酶活性,可导致组蛋白和非组蛋白的去乙酰化,引起众多生理活动的改变;EZH1是一种重要的组蛋白甲基转移酶,可介导组蛋白甲基化;因此本研究旨在深入分析SIRT1基因和EZH1基因的表达调控机制,寻找恶性血液病中决定两者基因表达的核心启动子区,探索表观遗传学改变对AML1-ETO阳性白血病发生发展的影响,提供了选择性靶向治疗的实验基础。方法：本研究第一部分利用RT-PCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株和白血病临床样本中初步研究AML1-ETO对SIRT1转录的影响。采用PCR法从含有SIRT1基因转录起始点5’区的基因片段中扩增SIRT1基因核心启动子序列,构建SIRT1基因序列的荧光素酶报告重组质粒,应用SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染293T细胞,采用双荧光素酶检测试剂盒测定重组质粒相对荧光素酶活性以定位SIRT1基因核心启动子位置。用SIRT1重组子分别转染AML1-ETO阳性和阴性细胞系,用SIRT1重组子与不同剂量的AML1-ETO质粒瞬时转染293T细胞,采用双荧光素酶报告检测方法,进一步研究AML1-ETO对SIRT1核心启动子转录活性的调节作用。第二部分通过定量RT-PCR和Western Blot的方法观察EZH1基因在AML1-ETO阳性和阴性细胞系中mRNA和蛋白表达水平变化。采用PCR方法从EZH1转录起始点的基因片段中扩增EZH1基因核心启动子序列,构建EZH1基因序列的荧光素酶报告重组子,应用SuperFect包裹荧光素酶报告重组质粒转染AML1-ETO阳性和阴性细胞系,采用双荧光素酶检测试剂盒测定重组质粒相对荧光素酶活性以定位EZH1基因核心启动子区。通过生物学信息分析发现EZH1基因启动子区含有多个AML1结合位点,用相同的方法构建突变体荧光素酶报告重组子,与相应的野生型重组子共同转染AML1-ETO阳性和阴性细胞系,以探索AML1-ETO融合蛋白在EZH1启动子区的结合情况。应用ChIP技术进一步探索AML1-ETO在EZH1启动子区的结合情况。应用特异的siRNA沉默EZH1的表达后使用CCK-8、PI染色法检测EZH1对AML1-ETO阳性细胞增殖和细胞周期的影响。结果：第一部分：RT-PCR方法检测白血病样本表明,与正常供者相比,AML1-ETO阳性的AML患者样本中SIRT1表达水平明显增高,4株细胞系,U937AE,U937,SKNO-1,SKNO-1-siAE(U937AE和SKNO-1为含有AML1-ETO融合基因的细胞株)中AML1-ETO阳性的细胞系,SIRT1表达水平明显增高。应用PCR法扩增了6段SIRT1基因序列,构建了6种SIRT1重组质粒,采用双荧光素酶检测试剂盒检测6种SIRT1重组质粒的荧光素酶活性,推断出了核心启动子位置位于启动位点上游1769bp-2060bpo用SIRT1重组子分别转染AML1-ETO阳性和阴性细胞系后检测其相对荧光素酶活性,结果表明细胞中敲除AML1-ETO后,核心启动子活性明显下调,应用SIRT1重组子与不同剂量的AML1-ETO质粒转染293T细胞后双荧光素酶检测结果示AML1-ETO融合基因数量的增加与核心启动子活性呈正相关关系。第二部分：定量RT-PCR和Western Blot表明AML1-ETO阳性细胞系(U937AE和SKNO-1)的EZH1mRNA和蛋白表达水平均显著上调,成功构建了8种EZH1重组子和4种突变体重组子,双荧光素酶活性检测8种重组子定位了EZH1的核心启动子位于下游1126-1164bp;用重组质粒和突变体重组质粒转染AML1-ETO阳性和阴性细胞系后检测其相对荧光素酶活性,确定了AML1-ETO与EZH1核心启动子的结合位点位于+1109bp, ChIP实验进一步证实AML1-ETO通过结合该位点激活EZH1核心启动子基因转录。EZH1表达沉默可以引起AML1-ETO阳性白血病细胞增殖能力和细胞周期受抑。结论：第一部分：SIRT1可能是AML1-ETO的靶基因之一。AML1-ETO与SIRT1基因的表达水平呈正相关关系,提示AML1-ETO通过促进SIRT1核心启动子活性对其进行正向转录调控。为深入研究SIRT1基因在白血病中的高表达以及通过抑制SIRT1选择性靶向白血病干细胞治疗提供了实验基础。第二部分：EZH1基因产物具有赖氨酸甲基转移酶活性,介导H3K27甲基化,AML1-ETO能够结合EZH1基因启动子区AML1位点导致EZH1的异常转录激活,通过组蛋白甲基化改变其他基因的转录状态,活化细胞周期和增殖,引起表观遗传学改变参与白血病发生发展,明确EZH1基因的AML1-ETO作用位点为新的临床治疗方法提供了理论依据。
【关键词】：AML1-ETO SIRT1 EZH1 表观遗传学 基因表达调控 荧光素酶报告基因 AML
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 引言12-20
• 第一节 急性髓系白血病的研究背景12-14
• 1 急性髓系白血病的发生发展12
• 2 t(8;21)急性髓系白血病12-14
• 第二节 SIRT蛋白家族的研究背景14-16
• 1 Sirtuins蛋白家族的来源和结构14
• 2 Sirtuins蛋白家族的功能14-16
• 第三节 EZH1的研究背景16-20
• 1 组蛋白甲基化16-17
• 2 EZH1的来源和功能17-20
• 第一部分 AML1-ETO融合基因对SIRT1基因表达调控的机理研究20-40
• 第一节 研究方法20-32
• 一 研究对象20
• 二 实验仪器20-21
• 三 实验试剂21-23
• 四 溶液配制23
• 五 实验方法23-32
• 第二节 结果32-37
• 一 AML1-ETO靶向调控SIRT132
• 二 SIRT1核心启动子区域的定位32-35
• 三 AML1-ETO对SIRT1进行转录调控35-37
• 第三节 讨论37-39
• 第四节 结论39-40
• 第二部分 AML1-ETO融合基因对EZH1基因表达调控的机理研究40-55
• 第一节 研究方法40-49
• 一 研究对象40
• 二 实验仪器40
• 三 实验试剂40-41
• 四 溶液配制41-43
• 五 实验方法43-49
• 第二节 结果49-53
• 一 AML1-ETO靶向调控EZH149-50
• 二 AML1-ETO融合蛋白结合EZH1核也、启动子区域的位点调节转录50-52
• 三 EZH1基因在AML1-ETO阳性白血病中的作用52-53
• 第三节 讨论53-55
• 第四节 结论55
• 小结55-56
• 附表56-58
• 参考文献58-62
• 文献综述62-68
• 参考文献65-68
• 攻读学位期间发表文章情况68-69
• 致谢69

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本文编号：526963