IR-780光热治疗及声动力治疗乳腺癌的实验研究

发布时间：2017-07-16 17:01

  本文关键词：IR-780光热治疗及声动力治疗乳腺癌的实验研究

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【摘要】：研究背景乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤,全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌的主要治疗方式是手术、放疗、化疗。尽管联合治疗在肿瘤治疗中具有单一治疗所不能比拟的优势,但是,有时联合治疗会增大治疗的副作用而使得患者不得不放弃治疗。寻找选择性好、副作用小的防治恶性肿瘤的新方法仍是当今医学研究的热点。光热治疗(Photothermal therapy,PTT)肿瘤是将光能转化为热能,加热病灶部位使温度达到临界治疗温度并维持一段时间,以杀死癌细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。光热治疗因其创伤小、副作用少以及高选择性等优点,从而逐渐得到临床医学的肯定。R-780碘化物是脂溶性的阳离子花青素染料,其最大吸收波长在780 nm,由于其具有强荧光性、良好的稳定性及嗜肿瘤性,已被认为是很好的肿瘤活体成像的荧光探针。此外,由于IR-780在近红外区有很强的吸收特性,故可被用来光热治疗。声动力治疗(SDT)是近年来兴起的一种新型治疗肿瘤的方法,声动力治疗的概念首先由日本的科学家Yumita提出,他们首次证实了低频超声能够激活光敏剂,产生类似于激光的激活过程,从而达到抑制肿瘤生长效果。声动力治疗是声敏剂选择性的聚集于肿瘤组织中,通过超声辐照,声敏剂被激活发生一系列化学反应从而达到抑制肿瘤生长的目的。SDT包括三个组成部分：声敏剂；超声；氧气分子。目前的声敏剂多来源于光敏剂,声敏剂是声动力治疗能否成功的关键因素之一。虽然声动力的治疗机制尚未完全阐明,然而,超声能激活声敏剂发生一系列化学反应来引发肿瘤细胞的坏死或凋亡。声动力治疗类似于光动力在治疗,但相较于光动力治疗,声动力治疗有两大明显优势：(1)超声波是种机械波,可以穿过人体组织到达深层的肿瘤里。(2)超声可以聚焦于特定的肿瘤区域从而有效的激活声敏剂。许多光敏剂可以作为声敏剂进行SDT,像卟啉和卟啉类衍生物等,这些分子不仅在PDT显示治疗效果同时在SDT中也有着明显的杀伤作用。鉴于光敏剂和声敏剂的吸收波长都很长,都可以在光照条件下被激活等共性,本实验的假设IR-780碘化物可以被超声激活进行SDT实验。第一章IR-780光热治疗小鼠乳腺癌移植瘤的初步研究目的：研究IR-780光热治疗(PTT)对小鼠乳腺癌的治疗效果。材料与方法一、主要试验材料IR-780碘化物,二甲基亚砜(DMSO)。称取一定量的IR-780溶于DMSO中,使其浓度为32 mmg/ml,再用无血清培养基稀释,终浓度为800μg/ml,备实验使用。单步法测凋亡(TUNEL)检测试剂盒。激光器；Vevo2100超高分辨率小动物超声成像仪；倒置荧光显微镜；石蜡切片机。二、实验方法在Balb/c小鼠右侧腹部皮下接种4T1乳腺癌细胞建立荷瘤动物模型进行实验,待肿瘤长到500mm3时,随机将荷瘤小鼠分为四组,①对照组：瘤内注射0.1ml生理盐水；②激光组：瘤内注射0.1ml生理盐水后行激光照射(2.2 W/cm2,4 min)；③IR-780组：瘤内注射0.1 ml即80μg IR-780溶液；④IR-780+激光组：瘤内注射80μgIR-780溶液后行激光照射(2.2 W/cm2,4 min)。游标卡尺测量并记录肿瘤大小,采用Vevo 2100超高分辨率小动物超声成像仪对四组小鼠给药后0h、12 h以及60 h时的肿瘤影像进行成像并采图,并对60 h后处死小鼠获取的肿瘤组合采用免疫组化方法TUNEL实验观察各组肿瘤组织凋亡情况。结果在治疗60 h后,IR-780+激光组肿瘤体积相较于IR-780组明显减小(P0.01),其余三组肿瘤体积无明显差异。在超声图上,IR-780+激光照射12h后肿瘤开始明显变小,超声回声稍有减低(P0.05)：60 h后肿瘤明显变小,回声明显减低(P0.01)。对照组、激光组、IR-780组除肿瘤稍有增大外,回声无明显改变。由TUNEL实验可见IR-780+激光组肿瘤凋亡明显增多(P0.01),而其余三组无明显差异。结论IR-780光热治疗对小鼠乳腺癌肿瘤具有明显杀伤作用,表现为肿瘤体积明显减小,肿瘤回声明显减低,大量肿瘤细胞凋亡。第二章IR-780声动力治疗乳腺癌细胞学研究及机制探讨目的研究IR-780声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)治疗乳腺癌细胞的抑制效应及机制研究。材料与方法一、主要试验材料IR-780碘化物；二甲基亚砜(DMSO)。称取一定量的IR-780溶于DMSO中,使其浓度为10 mM,再用胎牛血清稀释,终浓度为100μM备实验使用。细胞活性检测试剂盒；凋亡试剂盒；单线态氧试剂盒；过氧化氢基团检测试剂盒；羟基检测试剂盒。超声治疗仪；FACSCantoⅡ流式细胞仪；Accuri流式细胞仪；多功能酶标仪：Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜。二、实验方法通过FACSCantoⅡ流式细胞仪检测4T1乳腺癌肿瘤细胞在不同浓度的IR-780碘化物条件下,孵育不同时间时细胞对药物的摄取情况。采用CCK-8方法检测不同超声辐照时间(0 s、20 s、40 s)及不同IR-780碘化物浓度对小鼠4T1乳腺癌肿瘤细胞存活率的影响。通过流式细胞实验检测IR-780声动力治疗4T1细胞后凋亡坏死的比率,单线态氧试剂盒、过氧化氢基团检测试剂盒、羟基检测试剂盒检测自由基1O2、H2O2和·OH,探讨IR-780声动力治疗的机制。结果1、4T1细胞摄取IR-780碘化物有明显的剂量和时间依赖性,药物浓度为4μM、10μM、16μM在孵育时间1h、2h、3h时,同一药物浓度,随着孵育时间的延长,细胞的荧光强度增加。2、在无超声辐照时,4μM、10μM和16μM碘化物浓度对肿瘤细胞活性有轻微的抑制效应。在单独超声辐照时间为20s时,其对细胞活性没有明显的影响,但延长超声作用时间为40s时,其对肿瘤细胞活性有一些抑制的影响。当IR-780碘化物联合超声辐照时,肿瘤细胞的活性受到明显的生长抑制,且更高浓度的IR-780碘化物浓度或更长超声辐照时间,呈现出更高对肿瘤细胞生长抑制作用(P0.01)。3、与对照组相比,IR-780加上超声可明显诱导肿瘤细胞凋亡／坏死,其细胞凋亡／坏死在超声条件不变的情况下与IR-780碘化物浓度正相关。4、IR-780加超声辐照组作用于肿瘤细胞相较于其他组产生显著的102增加(P0.01)。IR-780加超声辐照组H202荧光强度相较于其他组最强(P0.01)。而在IR-780超声作用过程中并没有显著增加·OH自由基(P0.05)。结论IR-780可被4T1细胞高效摄取,通过联合超声SDT治疗可明显抑制4T1乳腺癌肿瘤细胞的活性,诱导肿瘤细胞凋亡/坏死。同时可明显增加肿瘤细胞内102和H202的产生。第三章IR-780声动力治疗乳腺癌动物模型的抑制效应目的研究IR-780声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)治疗乳腺癌移植瘤模型的抑制效应并对其机制进行进一步的探讨。材料与方法一、主要试验材料IR-780碘化物；二甲基亚砜(DMSO)。称取一定量的IR-780溶于DMSO中,使其浓度为32 mg/ml,再用无血清培养基稀释,终浓度为800μg/ml备实验使用。单步法测凋亡试剂盒；伊红染色液；苏木精染色液。超声治疗仪；倒置荧光显微镜；正置显微镜；小动物活体成像仪。二、实验方法通过瘤内注射IR-780溶液,在不同时间点通过小动物活体成像仪检测IR-780在小鼠瘤内不同时间点的荧光值,确定最佳的超声辐照时间。4T1移植瘤小鼠分为PBS组、超声组、IR-780组、IR-780+超声组,处理后观察小鼠肿瘤体积和体重的变化情况,研究IR-780声动力治疗体内治疗效果。肿瘤组织经HE染色观察组织形态学变化和TUNEL免疫组化检测组织凋亡情况。结果1、IR-780药物瘤内注射后沿肿瘤组织扩散,肿瘤区域的荧光信号强度逐渐增加,在药物注射1h时通过荧光图可见药物全部覆盖肿瘤并强度达高峰。时间大于6h后,会有IR-780碘化物渗透到周边正常组织。药物注射48 h后,IR-780在肿瘤内的含量仍占主导地位,其荧光值明显高于其他器官组织(P0.01)。2、老鼠在IR-780碘化物加上超声辐照时,肿瘤生长收到明显的抑制(P0.01)。相比之下,IR-780组和单独超声组和实验对照PBS组相比,并没有表现出明显的抑制肿瘤生长的效果(P0.05)。3、肿瘤切片经HE染色后可观察到IR-780加超声辐照后HE染色显著增加的细胞坏死。TUNEL染色结果证明IR-780进行SDT组与其他三组相比,TUNEL阳性细胞明显增多(P0.01)。结论IR-780作为声敏剂SDT治疗小鼠乳腺癌移植瘤,取得了明显的效果,HE染色及TUNEL实验可见IR-780加超声辐照后肿瘤组织凋亡坏死明显增多。
【关键词】：乳腺癌 IR-78 光热治疗 超声成像 凋亡 乳腺癌 IR-780 声动力治疗 凋亡 自由基 近红外成像 IR-780 声动力治疗 凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 参考文献19-21
• 第一章 IR-780光热治疗小鼠乳腺癌移植瘤的初步研究21-33
• 1 材料与方法21-24
• 1.1 材料21-22
• 1.2 方法22-24
• 2 结果24-29
• 3 讨论29-31
• 4 结论31
• 参考文献31-33
• 第二章 IR-780声动力治疗乳腺癌细胞学研究及其机制探讨33-51
• 1 材料与方法33-40
• 2 结果40-44
• 3 讨论44-47
• 4 结论47
• 参考文献47-51
• 第三章 IR-780声动力治疗乳腺癌动物模型的抑制效应51-64
• 1 材料与方法51-55
• 2 结果55-59
• 3 讨论59-61
• 4 结论61
• 参考文献61-64
• 攻读学位期间成果64-66
• 致谢66-67

【参考文献】

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1 田开亮;朱立新;许小亮;;光热疗法在浅表肿瘤治疗中的应用[J];现代肿瘤医学;2012年10期

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本文编号：549626