STOML-2抑制宫颈癌细胞铂诱导凋亡的机制

发布时间：2017-07-17 12:32

  本文关键词：STOML-2抑制宫颈癌细胞铂诱导凋亡的机制

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【摘要】：研究背景宫颈癌是全世界范围内第二高发的妇科肿瘤,仅仅次于乳腺癌。据最新统计,全球每年新发宫颈癌病例约53万例,占新发癌症总数量的9%,在女性因恶性肿瘤死亡的癌症类型中排名第四位。宫颈癌多发生于经济水平相对欠发达的地区,约85%的病例发生于发展中国家,59%发生于亚洲,其中,发展中国家年龄标化死亡率为10/10000,远高于发达国家。随着宫颈癌的预防筛查及手术、放化疗等综合治疗日益完善,近年来宫颈癌的发病率及死亡率虽有所下降,但我国仍是宫颈癌的高发国家之一,每年新发病例达到11万以上,且呈现年轻化的趋势,每年因宫颈癌死亡的女性高达2-3万。因此,宫颈癌仍是严重威胁女性健康并导致妇女死亡的恶性肿瘤之一。随着对肿瘤发生发展分子机制研究的不断深入,寻求临床上敏感有效的诊断指标和治疗靶点是科研人员的研究重点。STOML-2,最初在人类红细胞的膜蛋白发现而命名,其与人类多种疾病密切相关,如肾衰竭和贫血等。STOML-2/SLP-2与其他口型蛋白家族成员一样,拥有相同的序列,但不含有氨基末端疏水结构域,这有别于其他家庭成员。自从2006年以来,研究发现STOML-2在多种肿瘤组织高表达,比如食管鳞状细胞癌、胆囊癌、喉鳞状细胞癌、乳腺癌和胃癌等,并且STOML-2的高表达与肿瘤细胞的分化、转移、淋巴结浸润等密切相关。最新研究表明,STOML-2在宫颈癌肿瘤组织中也是高表达,其高表达与肿瘤分期、肿瘤大小和总生存期密切相关,但其确切的调控机制仍然不清楚,需要进一步的研究。食管鳞状细胞癌KYSE450细胞通过siRNA转染使STOML-2低表达后可以抑制肿瘤细胞的生长、增殖以及粘附等生物学行为。目前的癌症生物学研究表明,STOML-2可以通过调节能量代谢和细胞凋亡来增强代谢干预与基因毒性化疗药物的结合。STOML-2还可以调节线粒体钙离子外流,从而改变线粒体缓冲Ca2+和形成细胞内Ca2+信号的能力。关于STOML-2可能的生物学机制,有研究称,其可能参与食管鳞癌细胞线粒体功能的调节,从而在改变ATP产量平衡的水平抑制肿瘤细胞的运动和增殖。还有研究表明,上调STOML-2可能会大大增加基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达,这与肿瘤细胞的进展紧密相关,如侵袭,迁移,血管生成,和体外癌细胞转移等。此外,STOML-2沉默后可以显著抑制NF-κB的活性和其下游蛋白的表达水平。STOML-2可以调节肿瘤细胞的凋亡,但是,其抑制细胞凋亡的机制尚不清楚,有待进一步研究。实验方法1.细胞siRNA转染细胞于转染前一天用不含抗生素的完全培养基接种于6孔培养板,按以下配方稀释siRNA,预实验后可以适当调整siRNA与Iipofectamine2000的用量比；对于6孔板的每个孔,将5 u1的siRNA溶液与250 uL Opti-MEM混合：将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀,取5u1在另一管中与250 uL Opti-MEM混合,在室温下温育5 min；把稀释后的siRNA溶液与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合,轻轻地颠倒混匀,室温孵20 min；把siRNA与Lipofectamine2000的混合液加入细胞进行培养,根据实验需要收细胞或后续处理；RT-PCR和Western blotting检测干扰后的抑制效果。筛选转染目标干扰序列,选取干扰效率最高的一条siRNA,进行转染正式实验。2.细胞腺病毒过表达细胞于转染前一天用不含抗生素的完全培养基接种于6孔培养板,2-4×105个细胞/ml/孔,转染时,细胞融合率应为40-50%；按照不同的MOI值将腺病毒加入6孔培养板,将6孔培养板放入细胞培养箱培养；在感染细胞24、48、72小时分别用荧光显微镜观察细胞荧光表达情况。提取感染腺病毒细胞的全蛋白,用Western blotting检测基因过表达效果。筛选感染效率合适的MOI值,进行过表达正式实验。3.MTT实验(1)检测对细胞增殖的影响细胞经过siRNA转染或者腺病毒过表达处理后,将细胞置于37摄氏度,5%C02的孵箱中培养72小时；加入配好的MTT溶液20 ul/孔,于37摄氏度,5%C02培养箱避光孵育4小时,弃培养液,每孔加入DMSO溶液150 u1,振荡10min摇匀,利用酶标仪检测A490的OD值。(2)检测HELA细胞和SIHA细胞顺铂的IC50用浓度为0,5,10,15,20,25,30,35,40ug/ml的顺铂处理HELA细胞,用浓度为0,2.5,5,10,20,30,40,50,60ug/ml的顺铂处理SIHA细胞,将细胞置于37摄氏度,5%C02的孵箱中培养24小时；加入配好的MTT溶液20 ul／孔,于37摄氏度,5% C02培养箱避光孵育4小时,弃培养液,每孔加入DMSO溶液150 ul,振荡10min摇匀,利用酶标仪检测A490的OD值。4.细胞克隆形成实验取对数生长的细胞,按照500或1000个细胞／孔接种于6孔培养板中,每孔加入细胞悬液2ml,置于37摄氏度,5%C02培养箱内孵育24小时；按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞；将细胞置于37摄氏度,5%CO2的孵箱中培养7天,第4天换液一次；去掉6孔板中的培养基,用冷PBS轻柔的冲洗2次,用4%多聚甲醛固定15分钟,再用结晶紫染液染色20分钟,用流水冲洗干净,自然晾干,在显微镜下计数细胞数大于50个的细胞集落的数目。5.Annexin V-FITC法检测STOML-2对细胞早期凋亡的影响按照上述细胞转染步骤处理细胞,将细胞置于37摄氏度,5%C02的孵箱中培养48小时；更换新鲜的完全培养基,同时加入IC50量的顺铂,将细胞置于37摄氏度,5%C02的孵箱中培养6小时；离心收集细胞,300g,4摄氏度,5分钟,弃培养基；用冷PBS洗涤细胞2次,用400ul 1x AnnexinV结合液悬浮细胞,浓度大约为1×106cells/ml。在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC染色液,轻轻混匀后于4摄氏度避光孵育15分钟。加入10u1 PI染色液后轻轻混匀后于4摄氏度避光孵育5分钟。经流式细胞仪检测细胞凋亡比例。6.线粒体内钙离子浓度的检测按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞,将细胞置于37摄氏度,5%CO2的孵箱中培养48小时：更换新鲜的完全培养基,同时加入IC50量的顺铂,将细胞置于37摄氏度,5%C02的孵箱中培养6小时；将黑色96孔培养板标记为：细胞样品孔、空白对照孔(不含细胞)、最大对照孔(不含细胞)。用染色工作液处理各组细胞,放入37摄氏度细胞培养箱孵育30分钟,避免光照；即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光单位(RFU),计算样品线粒体内钙离子浓度。7.细胞凋亡线粒体膜电位的测定按照上述细胞转染步骤处理细胞,将细胞置于37摄氏度,5%CO2的孵箱中培养48小时；更换新鲜的完全培养基,同时加入IC50量的顺铂,将细胞置于37摄氏度,5%CO2的孵箱中培养6小时；用JC-1工作液处理各组细胞,置于37摄氏度,5%C02培养箱内孵育20分钟;室温离心2000rpm,5分钟收集细胞,用1×Incubation Buffer洗2次；吸取500ul lx Incubation Buffer重新悬浮细胞,采用流式细胞仪检测。8. RT-PCR按照上述细胞转染或者腺病毒过表达步骤处理细胞,提取RNA,逆转录形成cDNA,然后按照95℃30 see 1个循环、95℃5sec,60℃34 sec40个循环进行PCR,用2-△△Ct法进行相对定量分析,计算基因的相对表达量。9. Western blotting细胞经过各种处理后,提起全蛋白或者线粒体蛋白和胞浆蛋白,用恒压进行电泳,电泳结束后采用恒流的条件进行转膜,然后采用5%脱脂奶粉封闭1小时,4摄氏度过夜孵育一抗,避光孵育二抗1小时,用机器进行曝光,并用quantity one软件进行条带的定量分析。实验结果1. RT-PCR及Western blotting检测STOML-2沉默和过表达的效果采用siRNA转染HELA和SIHA细胞以干扰STOML-2基因的表达,RT-PCR及Western blotting的结果表明,以第2号siRNA干扰效率最高,在HELA细胞达65%,在SIHA细胞达到60%。用腺病毒感染HELA和SIHA细胞使STOML-2基因过表达,Western blotting的结果表明,与对照组相比,当MOI=400时,HELA细胞STOML-2的表达量达到200%以上；当MOI=50时,SIHA细胞STOML-2的表达量达到300%左右。2. STOML-2对宫颈癌细胞增殖的影响用siRNA转染HELA和SIHA细胞72小时后,MTT结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞的增殖能力降低,与对照组相比,分别降低了7%和14%,差异具有统计学差异(*P0.05,+P0.001)。用腺病毒感染HELA和SIHA细胞72小时后,MTT法结果表明,STOML-2过表达后HELA和SIHA细胞的增殖能力增强,与对照组相比,分别升高了8%和5%,差异具有统计学差异(*P0.05,+P0.001)。采用细胞克隆形成实验再次证明STOML-2对宫颈癌细胞增殖的影响,结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞的增殖能力降低,STOML-2过表达后HELA和SIHA细胞的增殖能力增强,上述结果再一次得到了验证。3. STOML-2对宫颈癌细胞凋亡的影响首先,采用MTT法计算出HELA和SIHA细胞顺铂的IC50,HELA细胞顺铂的IC50大约是20 ug/ml,而SIHA细胞顺铂的IC50大约是15ug/ml。其次,用IC50的顺铂作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA细胞6小时,用流式细胞仪检测。结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞的凋亡增加,并且差异具有统计学差异(*P0.05,+P0.001)。4. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体内钙离子浓度的影响用IC50的顺铂作用于STOML-2沉默或过表达的HELA和SIHA细胞6小时,用多功能酶标仪进行检测。结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞的线粒体内钙离子浓度增加,与对照组相比,分别增加了230%±13%和192%＋18%;STOML-2过表达后HELA和SIHA细胞的线粒体内钙离子浓度减少,与对照组相比,分别减少了47%±9%和42%＋9%,并且差异具有统计学差异(’P0.05,#P0.01)。5. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体膜电位的影响用IC50的顺铂作用于STOML-2沉默的HELA和SIHA细胞6小时,用流式细胞仪分析结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞的线粒体膜电位增加,与对照组相比,分别为3.8%vs17.9%,3.2%vs25.1%,并且差异具有统计学差异(*P0.05,+P0.001)。6. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体凋亡信号通路相关蛋白的影响用IC50的顺铂作用于STOML-2沉默或过表达的HELA和SIHA细胞8小时,提取线粒体蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting实验。结果表明,STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞从线粒体释放到胞浆中的细胞色素C增加,与对照组相比,线粒体中的细胞色素C减少,而胞浆中的细胞色素C增加；STOML-2过表达后HELA和SIHA细胞从线粒体释放到胞浆中的细胞色素C减少,与对照组相比,线粒体中的细胞色素C增加,而胞浆中的细胞色素C减少,并且差异具有统计学差异(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。用IC50的顺铂作用于STOML-2沉默或过表达的HELA和SIHA细胞24小时,提取全蛋白进行Western blotting实验。结果表明, STOML-2沉默后HELA和SIHA细胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达量减少,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值增加；STOML-2过表达后HELA和SIHA细胞p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达量增加,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的比值减少,并且差异具有统计学差异(’P0.05,#P0.01,+P0.001)。7.高浓度的顺铂可以诱导]HELA细胞中STOML-2基因的高表达用不同浓度的顺铂(0, 1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA细胞8小时,RT-PCR结果表明,STOML-2的表达量随着顺铂浓度的增加而增加。用不同浓度的顺铂(0,1×IC50,2xIC50,3xIC50,4xIC50,即0,20,40,60,80ug/ml)作用于HELA细胞24小时,Western blotting结果表明,STOML-2的表达量随着顺铂浓度的增加而增加,并且差异具有统计学差异(*P0.05)。8.高浓度的顺铂对宫颈癌细胞线粒体凋亡信号通路相关蛋白的影响首先,用不同浓度的顺铂(0,0.5×IC50,1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA细胞和SIHA细胞8小时,RT-PCR结果表明,在HELA和SIHA细胞中,与不加顺铂组相比,1xIC50组中STOML-2的表达量无明显变化；而与1xIC50组相比,2xIC50组中STOML-2的表达量明显升高,并且差异具有统计学差异(#P0.01,+P0.001)。其次,用不同浓度的顺铂(0,0.5×IC50, 1×IC50,1.5×IC50,2×IC50)作用于HELA细胞和SIHA细胞24小时,Western blotting结果表明：①在HELA和SIHA细胞中,与不加顺铂组相比,1xIC50组中STOML-2的表达量无明显变化；而与1xIC50组相比,2xIC50组中STOML-2的表达量明显升高,并且差异具有统计学差异(’P0.05,+P0.001)。②在HELA和SIHA细胞中,与1xIC50组相比,2xIC50组中p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达量明显升高,而Bax/Bcl-2, cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-PARP/PARP的表达量的比值明显降低,并且差异具有统计学差异(*P0.05,#P0.01,+P0.001)。结论(1) STOML-2高表达可以促进宫颈癌细胞的增殖能力；(2) STOML-2高表达可以抑制宫颈癌细胞的凋亡；(3)我们的研究结果首次表明,STOML-2可以通过激活MEK/ERK信号通路和抑制线粒体凋亡通路来抑制宫颈癌细胞的凋亡；(4)高浓度的顺铂可诱导宫颈癌细胞STOML-2的表达上调。
【关键词】：STOML-2 宫颈癌 顺铂 线粒体凋亡通路 MEK/ERK 信号通路
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-27
• 材料与方法27-46
• 一、材料27-30
• 二、实验方法30-46
• 结果46-62
• 1. RT-PCR及Western blotting检测STOML-2沉默和过表达的效果46-48
• 2. STOML-2对宫颈癌细胞增殖的影响48-50
• 3. STOML-2对宫颈癌细胞凋亡的影响50-52
• 4. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体内钙离子浓度的影响52-54
• 5. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体膜电位(MMP)的影响54
• 6. STOML-2对宫颈癌细胞线粒体凋亡信号通路相关蛋白的影响54-57
• 7. 高浓度的顺铂可以诱导HELA细胞中STOML-2基因的高表达57-59
• 8. 高浓度的顺铂对宫颈癌细胞线粒体凋亡信号通路相关蛋白的影响59-62
• 讨论62-66
• 参考文献66-71
• 攻读硕士学位期间成果71-72
• 致谢72-74

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本文编号：553637