超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药—微泡复合物抗肿瘤研究

发布时间：2017-07-17 12:29

  本文关键词：超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药—微泡复合物抗肿瘤研究

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【摘要】：背景与目的：阿霉素(Doxorubicin, DOX)是一种临床常用的蒽环类抗肿瘤药物。由于阿霉素可引起严重的心脏毒性、肾毒性及骨髓抑制等多种毒副作用,限制了其临床应用。因此,亟待发展一种新的肿瘤治疗策略以提高其治疗效果,降低毒副作用。研究发现,正常组织微环境呈中性,pH值约7.4,而肿瘤微环境中由于乏氧、低灌注以及乳酸代谢水平较高,其pH值可低至6.0。在载药体系中引入具有酸敏特性的化学键可使载药体系进入肿瘤组织后,在肿瘤酸性微环境的刺激下释放出化疗药物,而在体内正常组织中性微环境中则保持相对稳定。该策略可实现化疗药物在肿瘤区域的靶向释放,降低其毒副作用,提高药物抗肿瘤效率。在抗肿瘤药物研究中,引入靶向配体亦是增强药物靶向性的重要策略。据文献报道,整合素αvβ3在肿瘤新生血管内皮细胞及部分肿瘤细胞中高表达,精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp,简称RGD序列)是大多数整合素结合配体最常见的识别位点,但线型肽稳定性较差、体内易降解,而环状RGD(即cRGD)是一个基于二硫键循环的RGD肽,氨基酸序列为(cyclo-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys),稳定性好,可与整合素αvβ3特异性结合,有助于载药体系靶向肿瘤微血管,同时抑制肿瘤新生血管形成,在一定程度上产生抗肿瘤作用。叶酸受体作为另一个常用的肿瘤细胞靶点,在多种肿瘤细胞中高表达。在载药体系中引入cRGD肽和叶酸,可使载药体系在cRGD肽与整合素αvβ3的特异性识别下首先靶向结合于肿瘤区域血管床,然后在叶酸和cRGD的作用下靶向结合于肿瘤细胞,从而发挥双重肿瘤靶向作用。据此,我们将腙键的酸反应性及双配体的靶向性结合,制备一种酸敏双配体阿霉素前药。该前药以肝素为载体,通过碳二亚胺法连接双配体叶酸和cRGD肽,cRGD肽经聚乙二醇(PEG)修饰以逃避网状内皮系统吞噬及延长药物体内循环时间。化疗药物阿霉素则经酸敏腙键连接至载体上以促进其在肿瘤酸性微环境中的靶向释放。实验证明该前药具有比非酸敏双配体阿霉素前药及游离阿霉素更强的抗肿瘤能力。但随之我们发现酸敏键引入后,随着载药量增加纳米粒出现团聚,粒径增大,不利于载药体系在肿瘤内的进一步弥散和滞留,这也是目前各种药物传输体系在体应用时普遍面临的问题。超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)是一种有效的药物运输辅助手段,可促进药物定点释放。微泡破裂产生的微声流、冲击波及微射流等惯性空化作用可增加内皮间隙和细胞膜通透性,可有效地提高肿瘤部位的药物摄取,增强肿瘤细胞内药物蓄积。针对上述纳米粒团聚现象,我们期望利用超声空化的物理力学作用辅助团聚的载药体系分散均匀,提高应用效率。本实验通过生物素-亲和素桥将团聚的酸敏双配体阿霉素前药与微泡结合,形成酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物,并探讨微泡介导的超声辐照作用是否能将团聚的大粒径载药颗粒分散破碎成小粒径颗粒,从而增强肿瘤细胞对药物的摄取。本实验对超声作用前后酸敏双配体阿霉素前药及其复合物的形态及粒径变化进行考察,并通过系列体内外实验探究该策略的肿瘤靶向性、抗肿瘤能力及相关机制。材料与方法：1.合成酸敏双配体阿霉素前药按摩尔比称取一定量的羧基化肝素、氨基化叶酸、氨基化生物素、PEG-cRGD以及催化剂量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)下溶于二甲基亚砜(DMSO)中,室温反应24h后置于透析膜中透析48 h。通过腙键将阿霉素连接于载体肝素上,得酸敏双配体阿霉素前药。2.酸敏双配体阿霉素前药的表征动态光散射仪测量酸敏双配体阿霉素前药的粒径大小；透射电镜观察酸敏双配体阿霉素前药的形态及粒径；紫外分光光度法测定载药量。3.酸敏双配体载阿霉素前药-微泡复合物的制备3.1生物素化脂质微泡的制备按摩尔比称取一定量的DSPC、DPPE-Biot置于三颈瓶中,加入泊洛沙姆(F188)、PEG4000及25 mL蒸馏水,70℃水浴搅拌30 min,冷却至室温。把配制好的脂质混悬液加入至50 mL聚丙烯管内,将剪切刀头插至液面下,通入全氟丙烷气体2 min并进行剪切,制备得生物素化脂质微泡。3.2酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的制备按摩尔比将一定量的链亲和素加入生物素化微泡中,冰上孵育30 mmin,洗涤纯化去除未结合的亲和素,加入相应量的上述酸敏双配体阿霉素前药孵育30min,洗涤纯化去除未结合前药,得酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物。4.超声辐照装置本实验超声辐照由CZ906A超声空化治疗仪(四川绵阳索尼克电子有限责任公司)产生,根据前期实验体外细胞实验设定参数为：频率1 MHz,占空比50%,作用时间1 min, 功率1 W/cm2；体内动物实验设定参数为：频率1 MHz,占空比50%,作用时间1 min, 功率2 W/cm2。5.酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的表征透射电镜分别观察超声作用前酸敏双配体阿霉素前药的形态及超声作用于复合物后该前药的形态；动态光散射仪分别测量超声作用前酸敏双配体阿霉素前药的粒径大小及电位,及超声作用于复合物后该前药的粒径大小及电位；激光共聚焦显微镜观察脂质微泡与带红色荧光的酸敏双配体阿霉素前药的连接情况及超声作用后复合物的形态；库尔特计数仪对复合物进行粒径分析；计算酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的载药量。6.超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物体内外抗肿瘤特性研究6.1体外实验6.1.1体外药物释放实验将酸敏双配体阿霉素前药、等量的复合物及游离阿霉素(以载阿霉素量为定量指标)置于不同pH值的PBS液中(pH 5.0和7.4)进行透析,复合物组予以超声辐照。在特定的时间间隔分别取2 mL的透析液用于药物浓度检测(480nm,紫外分光光度计)。6.1.2流式细胞仪定量分析细胞摄取情况细胞常规培养后进行细胞计数,于6孔板内每孔加入约2.5×105个细胞,贴壁后,分别加入含等浓度阿霉素的酸敏双配体阿霉素前药、酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物及游离阿霉素的细胞培养液,复合物组加入药物后即予以超声辐照,经上述处理后放入孵箱孵育4h,制备单细胞悬液,流式细胞仪定量分析细胞摄取情况。6.1.3 MTT细胞毒性实验比较游离阿霉素、酸敏双配体阿霉素前药及超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物对MCF-7乳腺癌细胞的杀伤作用。细胞常规培养后接种于96孔板(5x103/孔),样品分为游离阿霉素组、酸敏双配体阿霉素前药组及其微泡复合物联合超声辐照组,分别加入相应药物及处理(均以阿霉素含量为定量依据,设定浓度梯度为0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL、3μg/mL,复合物组加入药物后即予以超声辐照),置于37℃孵育48 h,测定MCF-7细胞在不同条件作用后的相对存活率。6.2体内实验6.2.1超声分子靶向成像将成瘤裸鼠分为空白微泡组及复合物组,分别经尾静脉注射200此空白微泡及复合物(1 x 109/mL)。注射4 min后靶向微泡可结合于肿瘤组织,利用PhilipsiU22超声诊断仪Flash模式分别对空白微泡及复合物进行爆破,成像过程全程录像,并通过MCE彩色编码软件(MCE, Florida, USA)进行分析。6.2.2活体荧光成像实验将成瘤裸鼠随机分为Cy5.5标记的酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物无超声作用组、Cy5.5标记的酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物联合超声作用组及游离Cy5.5组,将相应药物经尾静脉分别注入荷瘤裸鼠中,超声作用组注入药物后即予以超声辐照。于药物注入后0.5、12、24、48及72小时将裸鼠经异氟烷麻醉,置于动物活体成像系统中进行活体成像。6.2.3体内抑瘤实验将成瘤裸鼠模型随机等分为对照组、游离阿霉素组、酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物无超声作用组及酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物联合超声作用组,每4天予以一次相应处理,连续5次。各实验组给药量均含等量阿霉素(2.5 mg/kg裸鼠体重)。治疗过程中,每2天进行一次裸鼠体重及肿瘤体积的测量。统计及分析各处理组对裸鼠皮下成瘤的抑制效果。6.2.4组织学实验6.2.4.1 HE染色评估药物毒性收集各处理组裸鼠肿瘤组织及各主要器官,固定、脱水、包埋、脱蜡至水,苏木精染色,盐酸酒精分化,自来水冲洗,伊红染色,梯度酒精脱水、透明、封片、镜检观察各组织是否可见组织坏死或损伤,评估药物毒性。6.2.4.2免疫组化检测细胞凋亡、细胞增殖及血管生成指标取材、固定、脱水、包埋及脱蜡步骤同HE染色；后行抗原修复,3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶,滴加相应一抗,切片平放于湿盒内4。C孵育过夜；滴加二抗,室温孵育50min;用新鲜配制的DAB显色液进行显色,苏木素复染细胞核,1%的盐酸酒精分化,自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗,脱水,中性树胶封片。7.统计学分析：采用SPSS 19.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以x±s表示。采用两独立样本t检验、单因素方差分析及重复测量方差分析进行统计学分析。设P0.05为差异性检验水准,定义*为p0.05,枣*为p0.01,料*为p0.001。结果：1.酸敏双配体载阿霉素前药的表征DLS检测发现酸敏双配体载阿霉素前药呈不均一的粒径分布,大部分粒径较小(149.6±29.8 nm),小部分粒径较大(1036.2±38.8 nm)。透射电子显微镜检测其形态及粒径发现,酸敏双配体阿霉素前药颗粒呈现略不规则的球形,部分聚集成团。紫外分光光度法测定酸敏双配体阿霉素前药载药量约18.9%。2.酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的表征2.1透射电镜观察可见超声作用后团聚的酸敏双配体阿霉素前药被破碎成均匀的小颗粒,呈类圆形的球体,DLS检测可见该前药粒径分布(平均直径：128.6±42.3nm, PDI:0.21),电位为-20.6±3.4 mV,结果与透射电镜观察所得一致。2.2激光共聚焦显微镜观察见超声作用前酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物分布均匀,无聚集现象,外壳发出红色荧光,表明带红色荧光的酸敏双配体阿霉素前药成功连接于微泡上。超声作用后,复合物被破碎成带红色荧光的均匀分布的碎片,提示超声外力作用于复合物有助于团聚颗粒分散均匀。2.3紫外分光光度计检测可得酸敏双配体阿霉素前药的载药量约18.9%,计算可得复合物的载药量约70.9μg DOX/108 MBs。库尔特计数仪测得该复合物粒径为5.87±0.08μm,PDI为0.09。3.超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物体内外抗肿瘤特性研究3.1体外实验3.1.1体外药物释放实验在pH7.4的PBS缓冲液中,酸敏双配体阿霉素前药组及其复合物联合超声作用组的阿霉素释放率均约30%,而在pH5.0缓冲液中,两者的阿霉素释放率分别提高至84%和90%,表明两者均具有较好的酸敏特性,提示微泡与该前药结合并未影响其酸敏特性,且超声的物理力学作用使超声联合复合物组的阿霉素释放率稍高于单独酸敏双配体阿霉素前药组。3.1.2细胞摄取实验流式细胞摄取实验可见,酸敏双配体阿霉素前药组及超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物组的细胞摄取率明显高于对照组及游离阿霉素组,差异均具有统计学意义(p0.01),提示腙键的酸敏特性及双配体的双重靶向性均可促进阿霉素的细胞摄取,且超声辐照联合复合物的细胞摄取率较单独的酸敏双配体阿霉素前药有所提高,可能原因为超声辐照通过使团聚药物破碎、粒径减小,使细胞膜通透性增加等机制进一步促进药物进入细胞。3.1.3 MTT细胞毒性实验游离阿霉素、酸敏双配体阿霉素前药及超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的细胞杀伤能力呈逐步上升趋势(IC50值分别为310.35 ng/mL, 217.43 ng/mL,120.23 ng/mL)。综合上述药物释放实验及细胞摄取实验结果,考虑酸敏双配体阿霉素前药在腙键的酸敏特性、双配体的双重靶向性及超声的物理力学及生物学作用下,通过促进阿霉素的释放及增加细胞摄取,抑制肿瘤细胞生长。3.2体内实验3.2.1超声分子靶向成像超声分子靶向成像数据采集后用彩色编码分析软件MCE进行图像分析,图像声强度以彩色编码显示,结果发现,酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物组肿瘤区域的声强度(52.785±4.341 a.u.)显著高于空白微泡组(15.021±2.340 a.u.),差异具有统计学意义(p0.001),提示酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物靶向结合于肿瘤组织的微泡量多于空白微泡,具有更强的肿瘤靶向显像特性。3.2.2动物活体荧光成像相对于Cy5.5标记的酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物无超声辐照组及游离Cy5.5组,超声辐照联合Cy5.5标记的酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物组在肿瘤区域的荧光信号显著增强,差异具有统计学意义(p0.01),其中以超声辐照联合复合物注射后0.5 h最强,定量数据显示差异可达3.5倍(p0.001),表明超声辐照联合复合物可使载药体系更早地在肿瘤区域达到更高的蓄积水平。3.2.3体内抑瘤实验体内抑瘤实验分为对照组、游离阿霉素组、复合物无超声作用组及复合物联合超声作用组。结果显示,相对于对照组,其余各组均显示出一定程度的肿瘤生长抑制。其中,阿霉素组的肿瘤抑制能力比复合物无超声作用组强,而复合物联合超声作用组显示出最强的肿瘤抑制能力(与对照组相比p0.001,与复合物无超声作用组相比p0.01,与游离阿霉素组相比p0.05)。各组裸鼠体重统计图显示,相对于对照组,游离阿霉素组裸鼠体重明显降低(p0.05),提示其具有一定程度的系统毒性,复合物无超声作用组裸鼠体重无明显降低,而复合物联合超声作用组与对照组相比体重差异最小,显示出最低的系统毒性。抑瘤实验末处死裸鼠,取出肿瘤组织并称瘤重。结果显示超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物组的肿瘤重量明显低于其余各组(对照组p0.001,游离阿霉素组p0.05,复合物无超声作用组p0.001),提示其较强的抑瘤能力,结果与上述肿瘤体积统计曲线一致。3.2.4组织学实验3.2.4.1 HE染色检测药物毒性抑瘤实验末取各组肿瘤组织及主要器官(心、肝、脾、肺、肾)作HE染色评估药物毒性。结果显示各组标本均未见明显的组织坏死或炎症等表现,推测可能由于本实验中所采用的阿霉素剂量较低,不足以引起明显的组织损伤。3.2.4.2免疫组化检测细胞凋亡、细胞增殖及血管生成指标相对于对照组、游离阿霉素组及酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物无超声作用组,超声辐照联合复合物组裸鼠肿瘤组织中Caspase-3(细胞凋亡指标)阳性细胞百分比明显升高(85%±3%),而Ki-67(细胞增殖指标)阳性细胞百分比明显降低(8.5%±1.5%),与其余各组比较差异均具有统计学意义(p0.001),提示超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物可更有效地促进细胞凋亡及抑制肿瘤细胞增殖。血管生成指标CD34检测发现超声辐照联合复合物组裸鼠肿瘤微血管密度相对于其余各组明显降低(p0.01),提示其较强的抗血管生成能力。复合物无超声作用组裸鼠肿瘤组织微血管密度相对于对照组及游离阿霉素组有所降低,而游离阿霉素组与对照组微血管密度差异无统计学意义。该结果表明超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物可能通过促进细胞凋亡、抑制细胞增殖及抗血管生成等多种机制发挥其抗肿瘤作用。结论：1.成功制备携带双配体cRGD肽和叶酸的酸敏阿霉素前药-微泡复合物,具有良好的肿瘤靶向显像特性及抑瘤性能,可实现诊疗一体化。2.超声辐照联合复合物可使团聚的前药分散均匀,减小粒径,有助于其抗肿瘤作用的发挥。3.在体外及体内实验中,超声辐照联合复合物可增强药物对肿瘤组织的靶向性,促进阿霉素在酸性环境中的释放,提高药物的抗肿瘤能力。4.该体系可能通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖及抗血管生成等机制发挥抗肿瘤作用。
【关键词】：超声 酸敏 阿霉素前药 微泡复合物 乳腺癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 前言21-25
• 参考文献23-25
• 第一章 酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物的制备及表征25-35
• 1. 实验材料26-27
• 2. 实验方法27-30
• 3. 实验结果30-32
• 4. 讨论32-33
• 参考文献33-35
• 第二章 超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药-微泡复合物体外及体内抗肿瘤研究35-58
• 1. 实验材料35-37
• 2. 实验方法37-42
• 3 实验结果42-51
• 4. 讨论51-55
• 参考文献55-58
• 缩略词58-59
• 成果59-60
• 附录60-61
• 致谢61-62

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本文编号：553620