木犀草素对乳腺癌细胞侵袭转移和上皮间质转换的作用及其机制研究

发布时间：2017-07-18 07:11

  本文关键词：木犀草素对乳腺癌细胞侵袭转移和上皮间质转换的作用及其机制研究

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【摘要】：目的:研究木犀草素(luteolin)对乳腺癌(breast cancer)细胞侵袭、转移和上皮间质转换的作用并探讨其分子机制。方法:1.在体外实验,用不同浓度木犀草素分别处理高侵袭转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞和BT549细胞。划痕实验及transwell实验分别检测乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力,评价木犀草素对乳腺癌细胞侵袭转移效应的影响;细胞微球体形成实验检测乳腺癌细胞的成球能力和流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞表面CD24/CD44的表达,评价木犀草素对乳腺癌细胞干性化特征的影响;免疫荧光细胞化学实验检测乳腺癌细胞间质型表面标记分子Vimentin和细胞骨架微丝肌动蛋白F-actin的表达和分布,定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)和免疫印迹实验(western blot,WB)分别检测乳腺癌细胞中上皮型标记分子E-cadherin、Claudin-1,间质型标记分子N-cadherin、Vimentin以及上皮间质转化的转录因子Snail、Slug的m RNA及蛋白表达水平,评价木犀草素对乳腺癌细胞上皮间质转换的影响。2.不同浓度木犀草素分别处理高侵袭转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞和BT549细胞,定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹实验分别检测乳腺癌细胞中b-catenin m RNA和蛋白表达水平。另外,分别转染MDA-MB-231细胞目的基因b-catenin的腺病毒载体Ad-b-catenin和对照腺病毒载体Ad-GFP,运用划痕实验和Transwell实验评价过表达b-catenin对木犀草素影响乳腺癌细胞迁移侵袭效应的逆转作用;定量逆转录-聚合酶链反应以及免疫印迹实验分析上皮型标记分子E-cadherin、Claudin-1,间质型标记分子N-cadherin、Vimentin以及上皮间质转化的转录因子Snail、Slug的m RNA及蛋白表达水平,评价过表达b-catenin对木犀草素影响乳腺癌细胞上皮间质转换过程的作用。3.在体内实验,4-5周龄裸鼠随机分为4组,包括空白对照组,木犀草素干预组,Ad-GFP+木犀草素组和Ad-b-catenin+木犀草素组。空白组和木犀草素干预组以皮下注射乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠原位乳腺癌模型,Ad-GFP+木犀草素组以皮下注射转染带GFP标记的空载病毒的乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠原位乳腺癌模型,Ad-b-catenin+木犀草素组以皮下注射转染带目的基因b-catenin的病毒的乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠过表达b-catenin的原位乳腺癌模型。待原位肿瘤长至体积约1cm3(14天)后,木犀草素干预组、Ad-GFP+木犀草素组和Ad-b-catenin+木犀草素组每三天腹腔注射木犀草素(100 mg/kg),空白对照组不做任何干预措施。8周后,处死小鼠,肺结节数计数、HE染色和Ki67检测木犀草素对乳腺癌细胞肺转移的影响以及过表达b-catenin对此影响的作用;免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光组织化学实验检测裸鼠原位肿瘤组织中间质型标记分子Vimentin、转录因子Slug及b-catenin的表达情况,评价木犀草素对乳腺癌肿瘤细胞上皮间质转换过程的影响及过表达b-catenin对此影响的作用。结果:1.木犀草素能剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞系中MDA-MB-231细胞及BT549细胞的迁移和侵袭能力。2.木犀草素显著抑制乳腺癌细胞的上皮间质转换过程。木犀草素使乳腺癌细胞从间质样形态转变为上皮样形态,改变细胞骨架微丝肌动蛋白F-actin的表达和分布状态;木犀草素剂量依赖性地上调乳腺癌细胞中上皮型标记分子E-cadherin、Claudin-1的表达,下调间质型标记分子N-cadherin,Vimentin以及转录因子Snail、Slug的表达,其中Slug的变化较Snail显著。3.木犀草素明显抑制乳腺癌细胞的成球能力和细胞表面CD24~(low)/CD44~(high)干性化标记分子的表达。4.木犀草素剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞中b-catenin蛋白和m RNA表达水平。5.过表达的b-catenin逆转木犀草素对转移性乳腺癌细胞的侵袭转移和上皮间质转换过程的抑制作用。6.木犀草素明显减轻裸鼠乳腺癌肿瘤的肺转移和抑制原位肿瘤细胞的上皮间质转换过程,而过表达的?-catenin逆转木犀草素的这一保护作用。肺结节数计数、HE染色和Ki67结果显示,裸鼠经木犀草素干预后,肺上肿瘤结节数减少,而肿瘤中?-catenin过表达后,肺上肿瘤结节数增加;免疫组织化学和免疫荧光组织化学结果显示,裸鼠经木犀草素干预后,裸鼠原位肿瘤中上皮型分子Vimentin、转录因子Slug及分子?-catenin表达减少,当?-catenin过表达后,Vimentin、Slug及?-catenin表达呈上调趋势。结论:木犀草素能抑制乳腺癌细胞的侵袭转移。这种抑制作用可能与木犀草素通过下调乳腺癌细胞?-catenin的表达,随后抑制其下游上皮间质转化的转录因子特别是Slug的表达,进而下调间质型标记分子Vimentin和N-cadherin,上调上皮型标记分子E-cadherin和Claudin-1的表达,抑制乳腺癌细胞上皮间质转换有关。
【关键词】：木犀草素 乳腺癌 侵袭转移 上皮间质转换 ?-catenin
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 1 材料和方法17-34
• 1.1 材料17-24
• 1.2 方法24-34
• 2 结果34-48
• 2.1 木犀草素对乳腺癌细胞迁移的影响34-35
• 2.2 木犀草素对乳腺癌细胞侵袭的影响35-37
• 2.3 木犀草素对乳腺癌细胞形态的影响37
• 2.4 木犀草素对乳腺癌细胞中Vimentin及F-actin表达的影响37-38
• 2.5 木犀草素对乳腺癌细胞中上皮间质转化相关分子表达的影响38-40
• 2.6 木犀草素对乳腺癌细胞成球能力和细胞表面CD24~(low)/CD44~(high)表达的影响40-41
• 2.7 木犀草素对乳腺癌细胞中 b-catenin蛋白和m RNA表达的影响41-42
• 2.8 过表达 b-catenin对木犀草素抑制乳腺癌细胞迁移作用的影响42-43
• 2.9 过表达 b-catenin对木犀草素抑制乳腺癌细胞侵袭作用的影响43-44
• 2.10 过表达 b-catenin对木犀草素抑制乳腺癌细胞中上皮间质转化相关分子蛋白水平和mRNA水平表达作用的影响44-45
• 2.11 木犀草素对裸鼠乳腺癌肿瘤肺转移情况的影响45-47
• 2.12 木犀草素对裸鼠原位乳腺癌肿瘤中Vimentin、Slug及 b-catenin表达的影响47-48
• 3 讨论48-52
• 结论52-53
• 参考文献53-59
• 文献综述59-72
• 参考文献66-72
• 致谢72-73
• 硕士期间发表的论文73

【参考文献】

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1 姜英;谢鲲鹏;霍洪楠;王丽梦;邹伟;谢明杰;;木犀草素下调AEG-1和MMP-2的表达对血管生成和乳腺癌细胞侵袭性的抑制作用[J];生理学报;2013年05期

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本文编号：556527