HCV核心蛋白对人Huh7肝癌细胞mRNA，lncRNA和circRNA表达的影响及其致癌机制初探

发布时间：2017-07-19 07:02

  本文关键词：HCV核心蛋白对人Huh7肝癌细胞mRNA，lncRNA和circRNA表达的影响及其致癌机制初探

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【摘要】：研究背景：丙型肝炎病毒(HCV)与慢性肝炎,肝硬化和原发性肝癌(HCC)的形成密切相关。核心蛋白作为构成HCV衣壳蛋白的结构蛋白,是HCV最重要的成分之一,其参与了包括HCV的免疫逃逸,因HCV感染导致的肝纤维化和HCC等肝脏疾病和抵抗药物治疗等过程。HCC作为一种高致死率的恶性肿瘤,近年来发病率持续升高,而细胞周期异常,凋亡抵抗和癌基因及相关通路的激活是其发生的主要分子机制。非编码RNA (ncRNA)是不编码蛋白质的RNA的总称,其中的长非编码RNA (lncRNA)是近年来生物医学研究的热点内容,其参与了生物生长发育和包括HCC在内的诸多疾病发病过程。新近发现的环状RNA(circRNA)由于其独特的结构和具有的如吸附miRNA以及参与癌症发生发展的相关信号通路等生物学功能,得到了越来越多的关注。已报道发现,有lncRNA参与到了乙型肝炎病毒(HBV)导致的肝癌中,例如HBV的HBx蛋白能下调lncRNA-Dreh从而促进肿瘤的生长和转移。但HCV或者其核心蛋白通过调控lncRNA分子导致HCC的研究却极为鲜见,考虑到HCV与HBV的相似性,可以推测HCV或者HCV核心蛋白导致HCC的过程中可能有lncRNA分子的参与。此外,circRNA在疾病诊断和治疗中的具有巨大的研究与应用前景,基于以上研究背景,本研究开展了如下工作：研究目的：以HCVIb基因型核心蛋白作为研究对象,探讨HCV核心蛋白对人Huh7肝癌细胞nRNA、lncRNA(?)circRNA表达的影响的研究,并初步分析HCV核心蛋白导致的HCC致癌的相关分子机制。研究方法：构建重组表达载体PEGFP-Core (HCV核心蛋白为基因型为lb),将该重组表达载体和空载体PEGFP-C1分别转染Huh7细胞,经G418筛选稳定转染细胞株并用RT-PCR检测核心蛋白的表达。在抽提RNA后通过lncRNA芯片和环状RNA(circRNA)芯片分析得到HCV核心蛋白表达对Huh7细胞基因表达谱的影响情况。随后找出表达差异2.0的lncRNA分子和circRNA分子,通过生物信息学分析,找出这些变化的分子与相关生理病理改变的关联性；并同时结合阅读文献和利用相关分子靶位点预测平台,挑选相关基因并给出预测的可能致癌通路,对其中的相关基因的差异表达情况进qPCR验证,最后通过构建相关相关基因的重组表达载体并瞬时转染Huh7-core细胞克隆,从而进一步对相关的信号通路进行探究。研究结果：LncRNA芯片包含两个部分,其中lncRNA检测部分含有30586个基因位点,mRNA检测部分含有26109个基因位点。结果显示,与对照组相比,有4851个lncRNA表达上调和3569个lncRNA表达下调超过2倍；4785个mRNA表达上调和3192个1nRNA表达下调超过对照组基因表达2倍。CircRNA芯片(含有5396个位点),分别发现了823个基因表达上调和419个基因表达下调超过对照组基因表达2倍。通过聚类分析和GO分析发现,这些分子参与了包扩细胞内大分子代谢,核酸代谢等代谢过程以及DNA损伤反应,钙离子通道调控等生化反应。通过KEGG Pathway分析,这些分子与内质网应激,凋亡,钙离子信号途径,Wnt信号途径,HBV, HCV感染等信号通路存在关联。此外经过qPCR验证了预测的信号通路中高表达或低表达的10个相关分子。最后通过构建信号通路中的相关分子(miR122, miR192, miR204)的基因表达载体,探讨了其表达对通路中其它分子可能的调控作用。结论：miR204-HPCALl, HOTTIP-GLS,和Circ0001498-miR122-TGFBRAP1这两条信号通路可能与HCVlb基因型核心蛋白参与HCV感染所致的HCC相关过程存在关联。
【关键词】：HCV核心蛋白 原发性肝癌 RNA芯片 lncRNA circRNA
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文缩略词9-11
• 前言11-13
• 综述13-38
• 文献综述(一) HCV核心蛋白与与肝细胞癌研究进展13-23
• 文献综述(二) 非编码RNA与肝细胞癌研究近况23-28
• 参考文献28-38
• 第一节 稳定表达HCV核心蛋白Huh7细胞克隆的筛选及基因表达谱分析38-67
• 前言38-39
• 1 材料和试剂39-40
• 2 实验方法40-54
• 3 实验结果54-62
• 4 讨论62-65
• 小结与展望65-66
• 参考文献66-67
• 第二节 HCV1b基因型核心蛋白在Huh7细胞中过表达的致癌机制初探67-83
• 前言67-68
• 1 材料和试剂68-69
• 2 实验方法69-74
• 3 结果74-78
• 4 讨论78-80
• 5 小结与展望80-81
• 参考文献81-83
• 致谢83-84
• 作者简介84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 Min Li;Qi Wang;Shun-Ai Liu;Jin-Qian Zhang;Wei Ju;Min Quan;Sheng-Hu Feng;Jin-Ling Dong;Ping Gao;Jun Cheng;;MicroRNA-185-5p mediates regulation of SREBP2 expression by hepatitis C virus core protein[J];World Journal of Gastroenterology;2015年15期

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本文编号：561633