ORAOV1在结肠癌中的表达及意义

发布时间：2017-07-21 00:23

  本文关键词：ORAOV1在结肠癌中的表达及意义

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【摘要】：研究背景及目的结肠癌(CRC,colorectal cancer)是目前发病率、诊断率均较高的胃肠道恶性肿瘤,好发于50-65岁之间的人群。据WHO统计,全球每年新增结肠癌患者近100万,而每年有约60万人口死于结肠癌。全球数据统计显示:对于男性而言,结肠癌的发病率紧随肺癌和前列腺癌,位居第三,而对于女性而言则是位于第二位的恶性肿瘤。结肠癌给人类健康带来的威胁极大,严重影响着患者健康及生活质量。流行病学调查发现,影响结肠癌发病的因素在发展中国家和发达国家之间不尽相同且具有明显的地域性,且在发展中国家其发病率与诊断率不断攀升,相较而言,低教育水平、低收入的人群结肠癌的发病率更高,这可能与相关人群的饮食习惯有关,在东亚国家结肠癌的发病与食用腌肉、肥胖、吸烟等因素有关。有关结肠癌发病机制的研究很多,目前公认的理论为:癌基因与抑癌基因的表达异常与之关系密切,但其发生发展的具体分子机制仍未得到阐明。染色体11q13区域的过度扩增现象广泛存在于各类肿瘤组织中,在肝癌、胃癌及结肠癌等消化系肿瘤中也同样存在,且与肿瘤转移及预后密切相关。口腔癌过表达蛋白1(ORAOV1,oral cancer overexpressed protein 1)又称肿瘤过表达序列1(Tumor Amplified and overexpressed seuqnce 1),编码基因定位于染色体11q13.3区域内,与Cyclin D1编码基因相邻,最初发现于口腔上皮肿瘤中,在体内广泛表达,以肝、胰腺、肾组织肿瘤中表达较高。既往研究表明,在结肠癌发生过程中存在11q13的过度扩增,特别是与该区域的Cyclin D1基因过表达密切相关,但Cyclin D1基因过表达不能完全解释结肠癌发生发展的分子机制,而ORAOV1的基因定位与Cyclin D1相邻,且在食管鳞状细胞癌的研究中表明:食管癌细胞中不仅Cyclin D1存在过表达现象,ORAOV1亦存在过度扩增,因此,我们推测在结肠癌组织中ORAOV1的表达也可能发生变化,并可能参与调控了结肠癌细胞的生物学行为。为验证上述假设,本研究拟在结肠癌及其相应的癌旁组织中检测ORAOV1的表达变化,并初步探讨该基因如何影响结肠癌细胞增殖能力和可能的原因,以期为结肠癌发生发展的分子机制及潜在治疗靶点的寻找提供实验依据。研究方法1.收集结肠癌切除术患者的结肠癌组织和癌旁组织:经中国人民解放军第三军医大学第三附属医院伦理委员会审查并取得患者及家属的知情同意后,2013年9月至2015年6月间,我们通过第三军医大学第三附属医院普外科收集结肠癌切除术患者的结肠癌组织和癌旁组织。收集的标本为:3.0×2.0×0.3cm,切成0.5×0.5×0.3cm,一部分保存于液氮中备用,另一部分做石蜡包埋,通过病理组织切片鉴定所收集的组织是否为结肠癌组织。2.利用人体组织标本研究ORAOV1在结肠癌的表达:(1)提取患者结肠癌组织和癌旁组织的RNA,逆转录后在m RNA水平研究ORAOV1是否表达增高;(2)提取患者的结肠癌组织和癌旁组织的总蛋白,在蛋白水平研究ORAOV1是否表达增高。以明确ORAOV1与结肠的发生具有相关性。3.利用Lo Vo和SW480细胞研究ORAOV1基因促进结肠癌发生的可能分子机制:构建p GPU6/GFP/Neo-sh-ORAOV1质粒和其相应的对照质粒,分别转染Lo Vo和SW480细胞,构建稳转细胞株;通过CCK8和流式细胞学实验,分别检测细胞增殖与凋亡情况,以明确ORAOV1基因的表达与细胞增殖和凋亡密切相关。结果1.在人结肠癌组织和癌旁组织的研究:(1)通过对人结肠癌组织进行H.E.染色对所收集的结肠癌标本进行病理分型,证实:我们所收集的结肠癌组织绝大部分为腺癌组织。(2)分别提取了结肠癌切除术患者的结肠癌组织和癌旁组织的m RNA和总蛋白,利用RT-q PCR和Western Blot技术检测ORAOV1的表达情况,证实:不论在m RNA水平还是蛋白水平,与癌旁组织相比,ORAOV1在结肠癌组织中表达增高。2.利用Lo Vo和SW480细胞的研究:(1)成功构建了ORAOV1 si RNA-Lo Vo、ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC、ORAOV1si RNA-SW480、ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞株:p GPU6/GFP/Neo-sh-ORAOV1质粒和其相应的对照质粒,分别转染Lo Vo和SW480细胞,G418 2000ug/ml筛选细胞5天后改为半量持续稳压筛选,提取各细胞株RNA,利用RT-q PCR检测ORAOV1基因的表达情况。结果表明:与Lo Vo WT(正常Lo Vo细胞株)相比,ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC细胞ORAOV1基因表达无明显变化,而ORAOV1 si RNA-Lo Vo则显著降低;在SW480 WT、ORAOV1 si RNA-SW480、ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞株中的结果与Lo Vo细胞株相似。因此,我们成功构建了ORAOV1 si RNA-Lo Vo、ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC、ORAOV1 si RNA-SW480、ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞株。(2)CCK8实验检测ORAOV1 si RNA-Lo Vo、ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC、Lo Vo WT、ORAOV1 si RNA-SW480、ORAOV1 si RNA-SW480 NC、SW480 WT细胞株的增殖情况:连续培养各细胞株96h,并于24h,48h,72h,96h进行CCK8检测,结果表明:不论在Lo Vo细胞系还是SW480细胞系,ORAOV1 si RNA转染细胞后,ORAOV1低表达,细胞增殖显著低于ORAOV1正常表达组。(3)流式细胞学对各稳转细胞株细胞周期的检测,结果表明:在Lo Vo细胞中,ORAOV1 si RNA-Lo Vo细胞处于S期的比例要明显高于ORAOV1si RNA-Lo Vo NC细胞(45.25%±3.17%,33.93%±2.23%,P0.05)和Lo Vo WT细胞(45.25%±3.17%,34.56%±2.20%,P0.05),而ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC细胞与Lo Vo WT细胞则无显著差异(33.93%±2.23%,34.56%±2.20%,P0.05)。而在SW480细胞中,结果显示:ORAOV1si RNA-SW480细胞处于的S期比例为54.49%±2.57%,而ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞处于S期比例仅为40.08%±2.36%,SW480 WT为40.12%±1.93%,与ORAOV1si RNA-SW480 NC细胞和SW480 WT细胞相比,ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞处于S期比例显著增高,结果具有统计学意义。而ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞和SW480 WT细胞相比较,结果无统计学意义。结果表明:ORAOV1低水平表达可引起结肠癌细胞细胞周期发生S期阻滞,降低增殖能力。(4)流式细胞学对各稳转细胞株早期调亡的检测,结果显示:在Lo Vo细胞中,ORAOV1 si RNA-Lo Vo细胞的早期凋亡比例高于ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC细胞(9.13%±1.39%,4.71%±0.65%,P0.05)及Lo Vo WT细胞(9.13%±1.39%,3.68%±0.36%,P0.05),差异均具有统计学意义;而ORAOV1 si RNA-Lo Vo NC细胞与Lo Vo WT细胞之间的早期凋亡则无明显变化(4.71%±0.65%,3.68%±0.36%,P0.05)。而在SW480细胞中相似的结果。即:ORAOV1 si RNA-SW480细胞的早期凋亡细胞比例高于ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞(15.76%±1.76%,6.74%±0.58%,P0.05),也同样高于SW480 WT细胞(15.76%±1.76%,5.82%±0.60%,P0.05),差异均具有统计学意义。且ORAOV1 si RNA-SW480 NC细胞组与SW480 WT细胞之间无明显差异(6.74%±0.58%,5.82%±0.60%,P0.05)。以上结果表明:ORAOV1低表达可增加结肠癌细胞Lo Vo及SW480的早期凋亡,从而影响结肠癌细胞增殖能力。结论:(1)ORAOV1基因在人结肠癌组织中表达增高。(2)ORAVO1基因敲除后能够影响细胞周期和细胞凋亡,而结肠癌组织中ORAVO1基因表达增高,可能通过减少细胞周期阻滞、减少凋亡而影响结肠癌细胞的增殖能力。
【关键词】：结肠癌 细胞凋亡 细胞增殖 口腔癌过表达蛋白1
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 ORAOV1在人结肠癌组织中的表达15-28
• 2.1 实验材料15-19
• 2.2 实验方法19-24
• 2.3 结果24-26
• 2.4 讨论26-28
• 第三章 ORAOV1对结肠癌增殖的影响28-44
• 3.1 实验材料28-30
• 3.2 实验方法30-34
• 3.3 结果34-41
• 3.4 讨论41-44
• 全文结论44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述 口腔癌过表达蛋白1在肿瘤细胞发生、发展中的研究49-56
• 参考文献53-56
• 在读期间发表的论文56-57
• 致谢57-58

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4 郭艳丽,闫慧明,宋善俊;组织因子在结肠癌表达的临床意义(英文)[J];中国现代医学杂志;2005年15期

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本文编号：570695