PKGⅡ对胃癌细胞VEGFR2介导的信号转导通路的影响及分子机制

发布时间：2017-07-25 19:18

  本文关键词：PKGⅡ对胃癌细胞VEGFR2介导的信号转导通路的影响及分子机制

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【摘要】：研究目的:研究II型cGMP依赖性蛋白激酶(Type II cGMP dependent protein kinase,PKG II)对人胃癌细胞血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)介导的主要信号转导通路及生物学效应的影响,探讨其相关的分子机制。研究方法:用编码PKG II cDNA的腺病毒(Ad-PKG II)感染胃癌细胞株HGC-27和AGS细胞,使其高表达PKG II,并用特异性激动剂8-pCPT-cGMP激活PKG II,用血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)激活VEGFR2,进行如下检测:采用Western Blot方法检测相关蛋白表达和磷酸化水平;采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI法和Matrigel血管生成实验分别检测细胞增殖、迁移、凋亡及新生血管形成;采用免疫共沉淀法检测PKG II与VEGFR2之间的相互作用;采用免疫沉淀法联合Western Blot法检测PKG II对VEGFR2丝/苏氨酸的磷酸化作用;采用位点突变法将VEGFR2的393位苏氨酸(Thr393)、439位苏氨酸(Thr439)和1231位丝氨酸(Ser1231)突变成丙氨酸,进而研究PKG II作用于VEGFR2的特异性磷酸化位点。研究结果:1.PKG II阻断VEGF-A引起的胃癌细胞VEGFR2酪氨酸磷酸化/活化,并抑制VEGF-A/VEGFR2介导的ERK1/2、MEK、Akt和mTOR的磷酸化/活化。2.PKG II抑制VEGF-A的促细胞增殖、迁移和血管生成作用及抗细胞凋亡作用。3.PKG II与VEGFR2相互结合,使其发生丝/苏氨酸磷酸化。4.PKG II磷酸化VEGFR2的Thr439和Ser1231位点,进而阻断VEGF-A对VEGFR2的激活。研究结论:PKG II通过结合VEGFR2并使其Thr439和Ser1231位点发生磷酸化,进而阻断VEGF-A对VEGFR2的激活,抑制VEGF-A/VEGFR2启动的信号转导,最终抑制VEGF-A/VEGFR2诱导的胃癌细胞的增殖和迁移;PKG II对VEGF-A/VEGFR2诱导的新生血管形成也有抑制作用,并拮抗VEGF-A/VEGFR2的抗凋亡效应。结果初步阐明PKG II为一有效的抗癌因子。
【关键词】：PKG Ⅱ VEGFR2 信号转导 胃癌细胞
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 英文缩写索引12-13
• 第一章 绪论13-20
• 1.1 胃癌的分子靶向治疗13-14
• 1.2 VEGFR2的现状14-15
• 1.2.1 VEGFR2的结构与功能14
• 1.2.2 VEGFR2与肿瘤的关系14-15
• 1.3 PKG Ⅱ的研究背景15-18
• 1.3.1 PKG的分类与分布15-16
• 1.3.2 PKG Ⅱ的结构16
• 1.3.3 PKG Ⅱ活性的调节16-17
• 1.3.4 PKG Ⅱ的主要功能17
• 1.3.5 PKG Ⅱ与肿瘤的联系17-18
• 1.4 研究目的和研究意义18
• 1.4.1 研究目的18
• 1.4.2 研究意义18
• 1.5 研究内容和技术路线18-20
• 1.5.1 研究内容18-19
• 1.5.2 技术路线19-20
• 第二章 PKG Ⅱ抑制胃癌细胞VEGFR2的活化20-29
• 2.1 材料和方法20-24
• 2.1.1 材料20-23
• 2.1.2 方法23-24
• 2.2 结果24-27
• 2.2.1 VEGFR2在胃癌细胞HGC-27和AGS中高表达24-25
• 2.2.2 PKG Ⅱ阻断VEGF-A诱导的VEGFR2酪氨酸1175位点磷酸化25-27
• 2.3 讨论27-29
• 第三章 PKG Ⅱ抑制胃癌细胞VEGFR2介导的MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路29-39
• 3.1 材料和方法29-30
• 3.1.1 材料29-30
• 3.1.2 方法30
• 3.2 结果30-36
• 3.2.1 PKG II抑制胃癌细胞VEGF-A/VEGFR2启动的MAPK/ERK信号通路30-34
• 3.2.1.1 PKG Ⅱ抑制VEGF-A/VEGFR2-MAPK/ERK通路中ERK1/2 的磷酸化31-32
• 3.2.1.2 PKG Ⅱ抑制VEGF-A /VEGFR2-MAPK/ERK通路中MEK1/2 磷酸化32-34
• 3.2.2 PKG II抑制胃癌细胞VEGF-A/VEGFR2启动的PI3K/Akt信号通路34-36
• 3.2.2.1 PKG Ⅱ抑制VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt通路中Akt的磷酸化34-35
• 3.2.2.2 PKG Ⅱ抑制VEGF-A /VEGFR2-PI3K/Akt通路中mTOR的磷酸化35-36
• 3.3 讨论36-39
• 第四章 PKG II对VEGF-A/VEGFR2调控的胃癌细胞增殖、迁移、凋亡及血管形成的影响39-55
• 4.1 材料和方法39-42
• 4.1.1 材料39-40
• 4.1.2 方法40-42
• 4.2 结果42-51
• 4.2.1 PKG II对VEGF-A/VEGFR2介导的胃癌细胞增殖的影响42-45
• 4.2.1.1 PKG II抑制VEGF-A诱导的增殖活动42-43
• 4.2.1.2 PKG II抑制VEGF-A诱导的PCNA表达增加43-45
• 4.2.2 PKG II对VEGF-A/VEGFR2介导的胃癌细胞迁移活动的影响45-48
• 4.2.2.1 PKG II抑制VEGF-A诱导的细胞迁移45-46
• 4.2.2.2 PKG II抑制VEGF-A引起的MMP2蛋白表达增加46-48
• 4.2.3 PKG II对胃癌细胞VEGF-A/VEGFR2介导的抗凋亡效应的抑制48-50
• 4.2.3.1 PKG II抑制VEGF-A诱导的抗凋亡效应48
• 4.2.3.2 PKG II对VEGF-A介导的Bcl-2 和Bax表达的影响48-50
• 4.2.4 PKG II拮抗VEGF-A诱导的新生血管生成50-51
• 4.3 讨论51-55
• 4.3.1 PKG II抑制VEGF-A诱导的胃癌细胞增殖51-52
• 4.3.2 PKG II拮抗VEGF-A诱导的胃癌细胞迁移52
• 4.3.3 PKG II抑制VEGF-A诱导的抗凋亡效应52-54
• 4.3.4 PKG II拮抗VEGF-A诱导的新生血管生成54-55
• 第五章 PKG II阻断VEGFR2活化的分子机制的研究55-67
• 5.1 材料和方法55-60
• 5.1.1 材料55-57
• 5.1.2 方法57-60
• 5.2 结果60-64
• 5.2.1 PKG II与VEGFR2相互作用60-61
• 5.2.2 PKG II诱导VEGFR2丝/苏氨酸磷酸化61-62
• 5.2.3 PKG II不能诱导突变体VEGFR2-T439A和VEGFR2-S1231A发生丝/苏氨酸磷酸化62-63
• 5.2.4 PKG II通过磷酸化VEGFR2的T439和S1231来抑制其活化63-64
• 5.3 讨论64-67
• 第六章 结论和展望67-68
• 6.1 主要结论67
• 6.2 展望67-68
• 参考文献68-80
• 致谢80-81
• 攻读硕士期间发表的论文81

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