URI抑制重铬酸钾诱导的SGC-7901细胞氧化应激、DNA损伤及其机制
本文关键词：URI抑制重铬酸钾诱导的SGC-7901细胞氧化应激、DNA损伤及其机制
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【摘要】：研究背景:铬(chromium,Cr)是一种天然的元素,在大气,土壤,岩石,微生物,植物以及动物体内都有发现。它主要以三价铬[Cr(III)]和六价铬[Cr(VI)]这两种价态的形式存在于自然界。其中Cr(VI)是已知的致癌剂。工业生产过程中的Cr(VI)是导致工人职业性肺癌的重要原因。长期暴露在污染的Cr(VI)环境中会对人体健康产生严重的危害,如肝肾器官损害、接触性皮炎、皮肤癌等。Cr(VI)导致的细胞氧化应激和DNA损伤是肿瘤形成的主要原因。除肺癌外,Cr(VI)还可导致消化道肿瘤等,但其具体机制还有待研究。URI(unconventional prefoldin RPB5 interactor,URI)属于前折叠素家族,可以与RNA聚合酶的亚基RPB5蛋白结合,主要参与多种基因转录水平的调控。研究结果表明,URI对维护线虫和果蝇基因组的稳定性发挥重要的作用,URI沉默后,会导致DNA损伤的累积从而导致细胞凋亡。URI也被认为是一个促癌蛋白,能够促进多种肿瘤细胞的增殖,并抵抗细胞凋亡。研究还发现URI是一种放射敏感蛋白。而重铬酸钾是一种常见的Cr(VI)盐,已被证实是一种化学致癌剂,但对其致癌机制目前尚不清楚。研究目的:对正常细胞而言,重铬酸钾具有细胞毒性和致瘤性。但肿瘤细胞对重铬酸钾处理后会有什么反应?面对细胞毒性,加强DNA损伤的修复和逃避死亡是肿瘤细胞的特性,而URI是一个癌蛋白,URI在重铬酸钾诱导的肿瘤细胞氧化应激DNA损伤等过程中是否具有保护作用?本研究通过敲低SGC-7901细胞中URI的表达,研究在重铬酸钾诱导SGC-7901细胞ROS产生,DNA损伤及修复,细胞死亡过程中URI的作用,进一步丰富对URI功能的理解,也为URI在重铬酸钾诱导肿瘤的形成过程提供新的思路。研究方法:(1)应用si RNA沉默技术在人胃癌细胞SGC-7901中敲低URI,设置si RNA-A干扰组,Scrambled无关序列组和Blank空白组。并采用免疫印迹方法检测其表达水平,验证URI敲低效果。(2)用DCH-DA试剂盒分别用流式以及荧光方法检测上述各组细胞在重铬酸钾作用后细胞内DCF的荧光强度,以此反映细胞ROS水平。(3)用彗星实验检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后的OTM值,设置重铬酸钾的浓度(1μM,10μM),用OTM值反映细胞DNA损伤程度及修复效率。(4)用Annexin V/PI染色试剂盒通过流式细胞术检测各组细胞在重铬酸钾处理后的细胞凋亡及坏死。(5)免疫印迹和免疫荧光方法检测各组细胞在重铬酸钾处理后相应蛋白的表达,包括抗凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1和促凋亡蛋白Bax以及凋亡诱导因子AIF等。(6)NAD+测定试剂盒检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后细胞中NAD+的含量。研究结果:(1)URI干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的ROS产生明显增加。(2)URI干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的DNA损伤明显增加,且在相对高浓度的重铬酸钾作用SGC-7901细胞后,URI干扰后抑制了细胞对DNA损伤修复的能力。(3)相对低浓度的重铬酸钾导致SGC-7901细胞的死亡主要是依赖线粒体途径的凋亡,而相对高浓度重铬酸钾作用SGC-7901细胞主要是依赖PARP1途径的坏死。并且URI干扰后,这两种细胞的死亡都明显增加。结论:(1)URI能够抑制重铬酸钾诱导的细胞ROS产生,说明URI参与了重铬酸钾诱导细胞氧化应激的调节。(2)URI能降低重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤,URI干扰后显著抑制了细胞在10μM浓度重铬酸钾作用后DNA损伤的修复效率。提示URI能影响重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤及其修复。(3)URI对重铬酸钾作用下的细胞存活发挥作用,URI能抵抗重铬酸钾诱导的细胞死亡。
【关键词】：URI 胃癌细胞SGC-7901 重铬酸钾 活性氧自由基 DNA损伤与修复 细胞死亡
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：
- 摘要5-9
- ABSTRACT9-13
- 主要英文缩略词索引13-17
- 第一章 绪论17-31
- 1.1 URI蛋白的功能研究17-18
- 1.2 铬的细胞毒性18-23
- 1.2.1 铬的代谢18-19
- 1.2.2 Cr(VI)与细胞氧化应激19-21
- 1.2.3 Cr(VI)的基因毒性21-23
- 1.3 DNA损伤与修复23-25
- 1.3.1 Cr(VI)导致的DNA损伤修复23
- 1.3.2 彗星实验检测DNA的损伤及修复23-25
- 1.4 细胞死亡25-29
- 1.4.1 细胞凋亡(apoptosis)25-27
- 1.4.2 凋亡调节蛋白27-28
- 1.4.3 细胞坏死(necrosis)28-29
- 1.4.4 PARP1与Parthanatos29
- 1.5 总结29-31
- 第二章 URI对重铬酸钾诱导SGC-7901细胞ROS产生的影响31-41
- 2.1 材料31-33
- 2.1.1 主要材料31-32
- 2.1.2 主要试剂32
- 2.1.3 主要仪器32-33
- 2.2 方法33-36
- 2.2.1 SGC-7901细胞培养33
- 2.2.2 转染URI siRNA干扰片段A33-34
- 2.2.3 蛋白印迹分析（Western blot）34-36
- 2.2.4 细胞内ROS水平的检测36
- 2.2.5 统计学分析36
- 2.3 结果36-39
- 2.3.1 Western blot检测SGC-7901细胞转染后URI的表达36-37
- 2.3.2 URI干扰后促进重铬酸钾诱导SGC-7901细胞ROS的产生37-39
- 2.4 讨论39-41
- 第三章 URI在重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的DNA损伤及修复中的作用41-52
- 3.1 材料41-42
- 3.1.1 主要材料41
- 3.1.2 主要试剂41-42
- 3.1.3 主要仪器42
- 3.2 方法42-45
- 3.2.1 Western blot检测 γH2AX42
- 3.2.2 免疫荧光检测 γH2AX42-43
- 3.2.3 彗星实验检测DNA损伤及修复43-44
- 3.2.4 统计学分析44-45
- 3.3 结果45-50
- 3.3.1 重铬酸钾浓度的选取45-46
- 3.3.2 URI能够减低重铬酸钾造成的SGC-7901细胞DNA损伤46-48
- 3.3.3 URI能促进SGC-7901细胞对重铬酸钾导致的DNA损伤修复48-50
- 3.4 讨论50-52
- 第四章 URI在重铬酸钾导致的SGC-7901细胞死亡中的作用52-68
- 4.1 材料52-53
- 4.1.1 主要材料52
- 4.1.2 主要试剂52
- 4.1.3 主要仪器52-53
- 4.2 方法53-56
- 4.2.1 CCK-8 试剂盒检测细胞存活率53
- 4.2.2 JC-1 检测线粒体膜电位53
- 4.2.3 PI染色检测ROS导致的细胞死亡53-54
- 4.2.4 流式检测细胞凋亡54
- 4.2.5 分光光度法检测细胞NAD+的含量54
- 4.2.6 免疫荧光检测AIF54-55
- 4.2.7 Western blot检测凋亡调节蛋白55
- 4.2.8 统计学分析55-56
- 4.3 结果56-65
- 4.3.1 URI干扰抑制了重铬酸钾作用后SGC-7901细胞的增殖56-58
- 4.3.2 URI干扰促进重铬酸钾诱导的SGC-7901细胞的坏死与凋亡58-60
- 4.3.3 URI在重铬酸钾导致SGC-7901细胞的凋亡与坏死的依赖途径中的作用60-65
- 4.4 讨论65-68
- 结论与展望68-70
- 结论68
- 展望68-70
- 参考文献70-83
- 致谢83-84
- 在学期间发表的学术论文84
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，本文编号：578033
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