纳米金棒-MUC1适配体复合物的构建及其靶向识别研究

发布时间：2017-07-29 12:13

  本文关键词：纳米金棒-MUC1适配体复合物的构建及其靶向识别研究

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【摘要】：【研究背景】肺癌是危害人类生命健康的常见疾病,其发病率和死亡率高居常见肿瘤之首。大部分肺癌患者因症状不明显,发现时多已进展至晚期,传统放疗、化疗等手段治疗效果不佳,新兴的靶向药物及免疫调定点阻滞剂在肺癌患者治疗中表现出持续获益,但均存在其局限性,在肺癌的诊断及治疗领域要有新的突破需寻求新的靶向治疗策略。纳米金棒(AuNRs)具有独特的生物相容性、表面修饰和功能化、高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光热转换效应等理化及生物性质,在肿瘤诊断和治疗领域展示出巨大应用前景,通常将表面修饰的AuNRs结合靶向分子构建具有主动靶向功能的AuNRs复合载体广泛应用于分子成像、靶向载药、放疗增敏、光热治疗等肿瘤诊断及治疗领域。核酸适配体是一种通过指数级富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从随机单链核酸序列库中逐层筛选扩增出的能特异性与靶标结合的小片段DNA或RNA,与传统抗体相比,具有高亲和性、免疫原性弱、易于大规模合成、易于体外修饰、易于穿透肿瘤组织等性质,成为理想的靶标分子。黏蛋白-1(Mucin-1,MUC1)是一种分布在呼吸道、腺体导管、胃肠道等上皮细胞表面的高度糖基化黏蛋白,研究已表明它与肿瘤的发生、肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移等过程密切相关,发生癌变时在细胞表面异常高表达,且暴露其核心肽上的相关抗原表位,使其成为一种广谱靶标分子。为充分发挥AuNRs和核酸适配子的高效性,可考虑通过SELEX技术筛选出能与肺癌细胞表面高表达的MUC1蛋白具有高度亲和性的MUC1适配体(MUC1-aptamer),并将MUC1适配体与表面修饰的AuNRs连接构建一种新的具有主动靶向功能的复合物,应用于肺癌的早期诊断及治疗领域的研究,探究肺癌细胞对这种复合物的摄取机制,并在此基础上进行靶向药物运载、在人体组织投射窗口予近红外激光照射等相关的靶向杀伤研究,以期为肺癌的新型靶向诊疗平台提供理论基础,为肺癌的早期诊断和治疗提供新的思路。【研究目的】1.如何通过严格控制实验条件,调节纳米金粒子纵横比以合成在525nm和近800nm波长处具有双spr峰的aunrs;2.筛选并合成能与肺癌a549细胞系表面高表达的muc1蛋白具有高度亲和的muc1-aptamer;3.在成功合成前两步目标物质基础上构建具有主动靶向功能的aunrs/muc1-aptamer复合物;4.探究所构建的新型靶向aunrs/muc1-aptamer复合物与高表达muc1蛋白的肺癌a549细胞系结合、摄取特点,对比纳米金棒被动靶向性的优势所在;5.探究给予人体组织投射窗口的近红外激光照射对靶向结合aunrs/muc1-aptamer复合物的a549细胞的特异性杀伤效应。【研究方法】1.改变agno3、ctab、抗坏血酸(ascorbicacid,aa)的浓度,调整纳米金粒子纵横比,通过金种子法诱导生长法(seed-mediatedgrowthmethods)合成在525nm和近800nm波长处具有双向spr峰的aunrs,并进一步通过紫外分光法测定验证,所得aunrs置于4℃保存备用;2.选取对muc1蛋白核心肽具有高亲和性的适配体s2.2作为目标muc1核酸适配体,并在单链muc1-aptamer的5’端修饰巯基以结合aunrs,在3’端修饰6’-fam荧光基团作为特异性结合靶细胞的检测标记,通过质谱检测验证合成目标适配体的序列正确性及纯度;3.通过纳米金棒的快速修饰法(rapidmodificationatlowph,rmlp)高效快速地将合成的巯基化muc1-aptamer修饰连接aunrs,并使用纳米金比色法、紫外分光法对所构建的aunrs/muc1-aptamer复合物的物理特性进行表征及验证;4.将所构建的aunrs/muc1-aptamer复合物分别与传代培养的肺癌a549细胞系及对照组肝癌hepg2细胞系孵育,流式细胞仪检测及荧光显微镜观察复合物与细胞的靶向结合与摄入,细胞表面荧光强度代表靶向复合物结合细胞的效率;5.利用aunrs的近紫外区吸收峰及光热转换特性,使用近红外光分别对与aunrs/muc1-aptamer复合物和aunrs孵育后的靶细胞进行照射,并使用mtt比色法检测对肿瘤细胞的杀伤效应,细胞存活率的大小与其孵育的药物毒性相关。【结果】金种子诱导生长法所合成纳米金棒通过紫外分光光度计法检测其紫外吸收波谱,在波长525nm和近800nm近红外光处可见双重等离子共振峰,即为目标所需AuNRs;将合成的巯基化MUC1-aptamer通过快速修饰法对AuNRs进行修饰,合成AuNRs/MUC1-aptamer复合物,通过纳米金的比色法和紫外分光光度计法检测紫外吸收波谱,可知靶向复合物构建成功,且该靶向复合物在波长525nm和近800nm近红外光处仍有可见双重等离子共振峰;构建的AuNRs/MUC1-aptamer复合物与A549细胞孵育后使用荧光显微镜观察细胞表面荧光强度显著高于其他各组,同时使用流式细胞仪定量检测细胞表面荧光强度,其荧光强度是AuNRs处理对照组5倍,差异显著,在肝癌HepG2细胞系未见明显差异,认为构建的靶向复合物与肺癌A549细胞系表现为特异性结合;分别与AuNRs/MUC1-aptamer复合物、AuNRs孵育的靶细胞经近红外光照射后,MTT比色法测定吸光值并算出各组细胞存活率,得出靶向复合物组+A549细胞组较阴性对照组及HepG2细胞系对照组细胞存活率明显降低,差异显著(P0.05)。【结论】综合分析本课题各部分结果得出:本研究成功构建了基于AuNRs和MUC1-aptamer结合的AuNRs/MUC1-aptamer复合物,该靶向复合物具有AuNRs的物理化学特性和适配子的靶向性,并能对细胞表面过表达MUC1蛋白的肺癌A549细胞系进行靶向识别,近红外光照射能对靶向结合AuNRs/MUC1-aptamer复合物的A549细胞具有特异性杀伤作用,这种构建的靶向复合物可为肺癌的靶向诊疗提供新的思路。
【关键词】：纳米金棒 核酸适配体 MUC1蛋白 肺癌 靶向治疗
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-19
• 1.1 肺癌危害及诊治现状12-13
• 1.2 纳米金棒特性及靶向应用前景13-17
• 1.2.1 生物相容性13
• 1.2.2 表面修饰和功能化13-14
• 1.2.3 金纳米棒靶向性14-16
• 1.2.4 表面等离子共振16
• 1.2.5 光热转换效应16-17
• 1.3 MUC1适配体作为主动靶向分子17
• 1.4 纳米金棒-适配体靶向复合物的应用17-18
• 1.5 本研究概述18-19
• 1.5.1 研究设计思路18
• 1.5.2 本研究创新点18
• 1.5.3 技术路线18-19
• 2 实验材料与方法19-29
• 2.1 主要实验试剂与仪器19-21
• 2.1.1 细胞株19
• 2.1.2 主要试剂19-20
• 2.1.3.主要试剂配方20
• 2.1.4 主要实验仪器与设备20-21
• 2.2 实验方法21-29
• 2.2.1 纳米金棒的制备及性质21-23
• 2.2.2 MUC1适配子的选择与合成23-24
• 2.2.3 纳米金棒与MUC1核酸适配子的制备24-25
• 2.2.4 A549/HepG2细胞培养25-26
• 2.2.5 结合靶向复合物细胞表面荧光检测26-27
• 2.2.6 近红外光对结合AuNRs/MUC1-aptamer细胞的靶向杀伤27-29
• 2.3 统计学分析29
• 3.实验结果29-35
• 3.1 纳米金棒特征29-30
• 3.2 巯基化的MUC1适配体S2.2 的合成及质谱检测30
• 3.3 纳米金棒与MUC1核酸适配体的制备30-32
• 3.4 结合靶向复合物细胞表面荧光检测32-33
• 3.5 新型靶向复合物对靶细胞的靶向杀伤33-35
• 4.讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-47
• 常用英文缩略词表47-48
• 已发表综述 纳米金应用于肺癌靶向诊疗的研究进展48-58
• 参考文献54-58
• 攻读学位期间发表论文58-59
• 致谢59-60

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本文编号：589114