GTFⅡF2突变体与CLIC1蛋白的相互作用

发布时间：2017-07-29 12:29

  本文关键词：GTFⅡF2突变体与CLIC1蛋白的相互作用

  更多相关文章： GTFⅡF2 酵母双杂交 免疫荧光 免疫共沉淀 RNA干扰

【摘要】：目的本文旨在研究证明GTFⅡF2突变体是否与CLIC1蛋白之间存在相互作用及GTFⅡF2的表达对食管癌细胞的增殖及迁移的影响,分别应用了质粒构建、酵母双杂交、间接免疫荧光、免疫印迹、GST pulldown、免疫共沉淀以及RNA干扰等实验技术,瞬时转染哺乳动物细胞、食管癌细胞或转化于酵母细胞加以证实,为探索GTFⅡF2的功能及其突变体和CLIC1蛋白功能的关系奠定一定的细胞学基础。方法根据不同的实验需求设计GTFIIF2突变体的上下游引物,利用PCR方法分别扩增缺失突变体GTFⅡF2-N:GTFⅡF2-(1-165 aa);GTFⅡF2(1-100 aa);GTFⅡF2(1-142 aa)和GTFⅡF2-C:GTFⅡF2(161-249 aa);GTFⅡF2(101-249aa);GTFⅡF2(143-249 aa),将酶切鉴定正确的重组质粒送公司测序。在内源性免疫共沉淀实验中,不转染任何质粒,分别利用GTFⅡF2和CLIC1抗体孵育和琼脂糖珠沉淀后,收集琼脂糖珠珠子western blot分析GTFⅡF2与CLIC1蛋白之间是否相互影响。酵母双杂交实验需要构建GTFⅡF2突变体的酵母表达质粒p GΑDT7-GTFⅡF2(1-165 aa),p GΑDT7-GTFⅡF2(161-249 aa),p GBKT7-GTFⅡF2(1-165 aa),p GBKT7-GTFⅡF2(161-249 aa),分别与实验室保存的p GBKT7-CLIC1,p GΑDT7-CLIC1共同转化于酵母感受态细胞ΑH109中,并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选,对长出的酵母克隆使用X-α-gαl进行活性测定,通过颜色筛选克隆是否变蓝来证明GTFⅡF2(1-165 aa),GTFⅡF2(161-249 aa)是否与CLIC1存在相互作用。构建GTFⅡF2各个突变体于pc DNA3.1和p CDGFP真核表达载体上,在间接免疫荧光实验中,分别将pc DNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pc DGFP-GTFⅡF2突变体或者FLΑG-GTFⅡF2突变体和pc DGFP-CLIC1共同转染到哺乳动物细胞COS7中,进行免疫荧光制片,通过激光共聚焦观察GTFⅡF2突变体是否与CLIC1存在共定位现象。在外源性免疫共沉淀实验中,分别将pc DNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pc DGFP-GTFⅡF2突变体共同转染到哺乳动物细胞HEK 293T中,利用FLAG抗体孵育和琼脂糖珠沉淀后,收集琼脂糖珠珠子western blot分析。在GST pulldown中,分别将GFP标签的相关质粒单独转染到哺乳动物细胞HEK 293T中与实验室保存的GST-CLIC1或者GSTGTFⅡF2突变体融合蛋白在体外混旋,收集谷胱甘肽珠子进行western blot分析GTFⅡF2突变体是否与CLIC1存在相互作用。人工合成靶向GTFⅡF2基因的si RNA序列和阴性对照si RNA序列及质粒pc DNA3.1-GTFⅡF2-FLAG,分别转染至食管癌细胞中,采用克隆形成实验和细胞划痕实验观察其对食管癌细胞增殖和迁移的影响。结果限制性内切酶双酶切鉴定重组质粒的结果和测序结果一致,证明重组质粒构建成功。内源性免疫共沉淀实验中,当用GTFⅡF2抗体免疫印迹后,能够检测CLIC1蛋白的存在,当用CLIC1抗体免疫印迹后,同样能够检测GTFⅡF2蛋白的存在,说明二者存在相互作用。酵母双杂交实验表明,分别表达了野生型GTFⅡF2与CLIC1和缺失突变体GTFⅡF2(1-165)与CLIC1蛋白的酵母细胞能够在SD3-培养基中正常生长,并且酵母克隆在进行α-半乳糖苷酶活性测定后颜色变蓝,证明二者存在相互作用;共同表达了GTFⅡF2(161-249)和CLIC1两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中不能够正常生长并且进行α-半乳糖苷酶活性测定后颜色没有变化,说明二者不存在相互作用。间接免疫荧光实验显示,FLAG-GTFⅡF2突变体与CLIC1在细胞核和细胞质中都有分布,二者在细胞质中的相同部位都有表达。GFP-GTFⅡF2-N在COS7细胞中主要分布于细胞质,与CLIC1蛋白无明显定位,而GFP-GTFⅡF2-C细胞核与细胞质均有分布,与CLIC1蛋白有明显的共定位。外源性免疫共沉淀实验显示,当用GFP抗体免疫印迹后,实验组GFP-GTFⅡF2突变体和CLIC1-FLΑG中能够检测到GFP-GTFⅡF2-N的存在,表明FLAG抗体在沉淀CLIC1-FLΑG的同时也将GFP-GTFⅡF2-N共同沉淀下来,即证明二者存在相互作用,并且相互作用的结构域在(1-100 aa)。GST pulldown实验显示,实验组GFP-CLIC1+GST-GTFⅡF2-N能够检测到GTFⅡF2-N的存在,表明GST-GTFⅡF2-N非GST-GTFⅡF2-C融合蛋白在体外条件下能够下拉GFP-CLIC1;实验组GST-CLIC1+GFP-GTFⅡF2突变体能够检测到GTFⅡF2-N的存在,表明GST-CLIC1融合蛋白在体外条件下能够下拉GTFⅡF2-N,则初步证明GTFⅡF2蛋白与CLIC1蛋白存在相互作用的结构域在(1-100 aa)。RNA干扰技术靶向沉默GTFⅡF2基因表达后,食管癌细胞的增殖和迁移均明显受到了抑制,而过表达GTFⅡF2对食管癌细胞的增殖和迁移没有明显的影响。结论内源性免疫共沉淀实验证实在GTFⅡF2与CLIC1相互作用,并且通过酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pulldown、间接免疫荧光等四种实验技术充分证明了GTFⅡF2-N和CLIC1蛋白在体内和体外实验中都存在相互作用,而且相互作用的结构域是在N端前100个氨基酸范围内。Knockdown GTFⅡF2抑制了食管癌细胞TE-1、ECA-109的增殖和迁移,为探索GTFⅡF2的功能及其突变体和CLIC1蛋白功能的关系奠定一定的细胞学基础。
【关键词】：GTFⅡF2 酵母双杂交 免疫荧光 免疫共沉淀 RNA干扰
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R735.1
【目录】：

• 英文缩略表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 1 引言14-17
• 2 材料与方法17-45
• 3 结果45-67
• 4 讨论67-70
• 5 结论70-71
• 6 对本课题的进一步设想71-72
• 7 参考文献72-77
• 附录77-79
• 致谢79-80
• 综述80-91
• 参考文献86-91

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本文编号：589229