活体成像系统在胶质母细胞瘤血管生长中的评估作用

发布时间：2017-07-29 15:35

  本文关键词：活体成像系统在胶质母细胞瘤血管生长中的评估作用

  更多相关文章： 绿色荧光蛋白 胶质母细胞瘤 慢病毒 皮下成瘤 活体荧光成像 胶质母细胞瘤血管形成

【摘要】：第一部分稳定表达绿色荧光蛋白胶质母细胞瘤细胞株建立及生物学特性评价目的:体外分离培养人胶质母细胞瘤,稳定传代培养后,通过慢病毒转染构建稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株GBM-EGFP,并对其生物学特性进行评价。方法:通过慢病毒载体将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flurescent protein EGFP)慢病毒转染原代GBM细胞株,并进行筛选和扩大培养,构建出稳定表达EGFP的单细胞克隆株:GBM-EGFP。体外经10次传代后流式细胞分析检测细胞株荧光表达的稳定性;对GBM及GBM-EGFP两种细胞株在生长周期,细胞生长曲线,侵袭性,VEGF的表达及裸鼠皮下成瘤方面进行观察,观察经慢病毒转染后构建的细胞株GBM-EGFP较原代细胞的生物学特性是否发生改变。结果:通过慢病毒介导转染胶质母细胞瘤,通过筛选及单克隆建立GBM-EGFP细胞株,能够在体外稳定持续表达绿色荧光蛋白。经过30天体外培养后,能高效稳定表达绿色荧光,流式分析检测表达率为84%;细胞形态较原代细胞未发生改变。GBM-EGFP细胞株生长曲线、细胞周期、侵袭能力与未转染的原代GBM一致。将GBM-EGFP细胞注入BALB/c-nu小鼠皮下,分别建立GBM及GBM-EGFP裸鼠皮下模型,显示两者在成瘤率、肿瘤生长趋势方面及肿瘤组织形态学上无差异。结论:通过慢病毒载体介导的转染方法建立起来的GBM-EGFP细胞株能稳定高效表达绿色荧光蛋白,细胞生物学特性与母系GBM基本一致,为研究胶质瘤的复发及转移提供了一个良好的工具。第二部分活体成像系统在胶质母细胞瘤血管生长中的评估作用目的:通过活体成像系统建立稳定表达绿色荧光蛋白的胶质母细胞瘤皮下肿瘤模型,动态观察肿瘤生长及血管生成,分析两者之间的关系,从而为研究胶质母细胞瘤的转移复发,评估靶向治疗提供有效的动物模型。方法:建立小鼠皮下肿瘤模型:取25只裸鼠随机分成5组,于4周龄大小时皮下注射1x106个GBM-EGFP细胞。另取9只作为对照组,注射1x106个GBM细胞,分别于1w,1.5w,2w,2.5w,3w,3.5w,4w,4.5w,5w时以活体成像系统观察小鼠肿瘤荧光表达情况,测定荧光值(以光子数表示)。并于活体成像后取实验组及参照组裸鼠各一只取肿瘤组织行HE染色及人CD34免疫组化(IH)观察肿瘤血管发生及形态,统计微血管密度(MVD),同时行CD34免疫荧光(IF)观察肿瘤来源内皮细胞。体外取不同细胞浓度的细胞送活体成像系统,分析不同浓度细胞与荧光值之间的关系,用以计算肿瘤不同时间段肿瘤内细胞数,从而分析肿瘤生长与血管发生及血管形态之间的关系,最后以流式加以验证。结果:体外实验显示GBM-EGFP荧光表达稳定,且荧光强度与细胞数呈直线正相关。小鼠活体成像系统显示接种后1w后肿瘤可在活体成像系统中观察到荧光,荧光表达随肿瘤生长逐渐增强。HE染色及免疫组化显示肿瘤接种后3d开始出现幼稚血管,1w开始肿瘤中央开始坏死,坏死周围出现血管出芽结构,MVD在3-4w时增值最快,4w达到峰值,此后进入平台期,流式结果分析显示4w时CD34+阳性率为1.63%。结论:通过活体成像系统可建立稳定表达绿色荧光的胶质瘤皮下肿瘤模型,实现了对胶质瘤体外生长的长期动态观察,为研究胶质瘤的体外生长提供了良好模型;同时通过免疫荧光观察到肿瘤来源的内皮细胞,统计了MVD,并以流式加以验证,为肿瘤来源内皮细胞分选创造了条件。
【关键词】：绿色荧光蛋白 胶质母细胞瘤 慢病毒 皮下成瘤 活体荧光成像 胶质母细胞瘤血管形成
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一部分：稳定表达绿色荧光蛋白胶质母细胞瘤细胞株建立及生物学特性评价9-28
• 前言9-10
• 材料及方法10-19
• 结果19-24
• 讨论24-26
• 结论26
• 参考文献26-28
• 第二部分：活体成像系统在胶质母细胞瘤血管生长中的评估作用28-51
• 前言28-29
• 试剂及材料29-30
• 实验方法30-35
• 结果35-47
• 讨论47-50
• 结论50-51
• 本研究的不足及展望51-52
• 参考文献52-54
• 缩略词表54-55
• 在校期间发表的论文列表及参与科研项目55-56
• 致谢56

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本文编号：589899