纳米金颗粒介导的高效筛选免疫原性多肽的研究

发布时间：2017-07-29 22:20

  本文关键词：纳米金颗粒介导的高效筛选免疫原性多肽的研究

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【摘要】：肿瘤对人类健康的危害非常严重,尽管医学科技领域科学家们也一直致力于治愈肿瘤,然而至今它依然是一种难以攻克的疾病。肿瘤免疫治疗方法的出现,燃起了人们新的希望,随着研究的深入,肿瘤的免疫治疗正取得越来越明确的效果,这一治疗手段已使很多患者受益,因此也被《科学》杂志评列为2013年十大科学突破之首。免疫治疗可分为抗体免疫治疗和细胞免疫治疗。在这两种途径中,抗体免疫治疗法采用PD-1或CTLA-4等免疫检查点抑制抗体消除体内环境对T细胞的抑制,使其能够继续杀伤肿瘤细胞;细胞抗肿瘤免疫治疗则是通过体外培养患者自身的免疫细胞,激活其免疫功能并回输至患者体内发挥作用,常见的有DC-CTL疗法及表达嵌合抗原受体的自体T细胞(CAR-T)疗法等。在肿瘤免疫治疗过程中,肿瘤抗原需要能够被正确的递呈给淋巴细胞,形成针对肿瘤抗原特异性的T细胞克隆,进而形成有效的抗肿瘤免疫反应。通常来说,这一过程借由抗原递呈细胞如树突状细胞(DC)摄取、加工处理并递呈。嵌合抗原受体方法的出现则直接将包含肿瘤抗原识别区的序列通过基因修饰的方法直接导入T细胞,从而识别携带特定抗原的肿瘤细胞并引发免疫反应。但无论何种方法,其核心都需要建立在正确的肿瘤抗原基础上。随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的发展,肿瘤的异质性不断地被揭示。因此,如何在癌症的大量突变基因中快速准确地筛选出具有治疗效应的抗原信息是新型精准医疗概念的重要组成部分。计算机模拟技术的成熟使抗原表位的预测及高通量筛选成为了一种可能,已有研究结果证实模拟预测的多肽序列能够具有较强的免疫原性。但在实际操作中,受限于计算条件及时效性的影响,需要更为普适的筛选方法。目前常用的能够将多肽导入细胞的方法包括电转法、脂质体法及腺病毒法等,但各有其劣势且均不适合高通量筛选的目的。本课题涉及的纳米金颗粒在携带各种物质进入细胞方面拥有许多临床应用,相比其他材料、方法拥有更多的优势,但将其用于抗原表位的筛选却罕有报导。因此,本课题选择纳米金颗粒作为高通量筛选的载体,通过其与抗原多肽的偶联,进入抗原递呈细胞,最后通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)精确检测抗原多肽的免疫原性强弱,达到筛选目的。本课题从光谱分析上证实纳米金颗粒与合成多肽的偶联,从荧光及电镜图片上直接证实其进入细胞,从T细胞IFN-γ的分泌上验证了不同多肽的免疫原性,确立了整体实验方法的可行性。同时对各实验参数如pH、缓冲液、培养时间等进行了优化,从待筛选多肽的合成直至免疫原性结果的分析所需的时间非常短。并且成功将体系缩小至96孔板规模,从而实现高通量筛选的最终目的。本课题涉及的抗原表位高通量筛选平台技术联合计算机模拟预测抗原表位技术必将极大地推动肿瘤的精准治疗的发展与应用。
【关键词】：纳米金颗粒 高通量筛选 免疫原性多肽 抗原表位
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 绪论12-21
• 1 前言12
• 2 肿瘤疗法简介12-13
• 2.1 手术切除法12-13
• 2.2 化学治疗法13
• 2.3 靶向治疗法13
• 3 肿瘤的免疫治疗13-16
• 3.1 细胞免疫治疗14
• 3.2 抗体免疫治疗14-15
• 3.3 免疫应答机制15-16
• 4 肿瘤抗原的加工处理16-18
• 4.1 传统导入法16-17
• 4.2 纳米金导入法17-18
• 5 研究目的及意义18-20
• 6 技术方法和路线20-21
• 第二章 纳米金颗粒与多肽偶联条件的探索21-34
• 1 前言21
• 2 材料与方法21-26
• 2.1 材料、仪器和试剂21-23
• 2.1.1 主要材料21
• 2.1.2 主要仪器21-22
• 2.1.3 主要试剂22-23
• 2.1.4 试剂配制23
• 2.2 实验方法23-26
• 2.2.1 免疫原性多肽的合成23-24
• 2.2.2 纳米金颗粒与多肽偶联24-25
• 2.2.2.1 不同pH对偶联的影响24
• 2.2.2.2 不同稀释剂对偶联的影响24-25
• 2.2.2.3 金硫不同摩尔比对偶联的影响25
• 2.2.3 高通量筛选多肽25
• 2.2.4 荧光显微镜及电镜检测细胞摄取情况25
• 2.2.5 初步检测多肽免疫原性25-26
• 3 实验结果26-33
• 3.1 不同pH对纳米金颗粒与免疫原性多肽偶联的影响26-27
• 3.2 不同稀释剂对纳米金颗粒与免疫原性多肽偶联的影响27-28
• 3.3 金硫不同摩尔比对偶联的影响28-29
• 3.4 高通量筛选多肽29-30
• 3.5 偶联复合物细胞实验及电镜检测30-32
• 3.6 不同多肽进入细胞后的免疫原性检测32-33
• 4 讨论33-34
• 第三章 纳米金颗粒与多肽偶联复合物功能研究34-42
• 1 前言34
• 2 材料与方法34-37
• 2.1 材料、仪器和试剂34-36
• 2.1.1 主要材料34
• 2.1.2 主要仪器34-35
• 2.1.3 主要试剂35
• 2.1.4 试剂配制35-36
• 2.2 实验方法36-37
• 2.2.1 293A细胞培养36
• 2.2.2 巨噬细胞制备及培养36
• 2.2.3 DC细胞的制备36
• 2.2.4 细胞与偶联复合物作用时间对细胞摄取效率的影响36-37
• 2.2.5 细胞与偶联复合物不同体积比对细胞摄取效率的影响37
• 2.2.6 免疫原性多肽的筛选37
• 3 实验结果37-41
• 3.1 不同种类的细胞对于纳米金-多肽复合物的摄取能力探究37-38
• 3.2 不同处理时间对于细胞摄取偶联复合物的影响38-39
• 3.3 多肽免疫原性检测39-41
• 4 讨论41-42
• 第四章 结论和展望42-44
• 参考文献44-49
• 致谢49

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本文编号：591330