姜黄素联合吉非替尼对非小细胞肺癌NCI-H1975作用及机制研究

发布时间：2017-07-30 02:01

  本文关键词：姜黄素联合吉非替尼对非小细胞肺癌NCI-H1975作用及机制研究

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【摘要】：研究目的：研究姜黄素联合吉非替尼对人非小细胞肺癌NCI-H1975细胞耐药性,以及增殖克隆、凋亡的影响,并进一步探讨其可能的分子机制。研究方法：通过早期实验,发现吉非替尼对NCI-H1975细胞的IC50为8μmol/L,姜黄素对NCI-H1975细胞的IC15为10ng/ml。以不同浓度的吉非替尼(2、4、6、8、10) μmol/L单独或联合10ng/ml姜黄素处理细胞,设立不给药作为空白对照组,每个处理组分别设3个复孔,培养24小时后采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测姜黄素联合吉非替尼对吉非替尼抑制NCI-H1975细胞增殖抑制的影响。同时,分别以IC15浓度的姜黄素10ng/ml、IC50浓度的吉非替尼8μmol/L、及两药联用(姜黄素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)处理细胞,设立不给药为空白对照,利用Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测两药单独及联合处理后对NCI-H1975细胞凋亡的影响；用蛋白质印迹法(Western Blotting)检测MAPK途径中的P-P38、P-ERK1/2、 P-NF-κB,PI3K/AKT途径中的P-AKT蛋白表达；通过集落形成实验计数克隆集落数的方法,研究姜黄素、吉非替尼单独及联合处理NCI-H1975细胞后细胞的克隆形成能力；用鼠抗人抗P-gp-FITC单克隆抗体对姜黄素、吉非替尼单独及联合药物处理后的细胞进行染色,流式细胞仪上机检测细胞膜表面P糖蛋白的表达。研究结果：1.MTT法检测不同浓度的吉非替尼(2、4、6、8、10)μmol/L单独或联合10ng/ml姜黄素处理细胞,同时设立不给药作为空白对照组,每个处理组分别设3个复孔。分析结果显示,药物处理24h后,姜黄素与吉非替尼联合用药较单用吉非替尼在各浓度上(2、4、6、8、10μmol/L)均可提高吉非替尼对NCI-H1975细胞的增殖抑制作用(p0.05)；lOng/ml姜黄素联合吉非替尼可降低吉非替尼的半数抑制浓度IC50(1.98±0.67μmol/L VS 8.15±2.31μmol/L),差异具有统计学意义(p0.05)。2.利用Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测以10ng/ml浓度的姜黄素、8μmol/L浓度的吉非替尼及两药联用(姜黄素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)对NCI-H1975细胞作用24小时后细胞的凋亡率,同时设立不给药作为空白对照组。空白组、姜黄素、吉非替尼及两药联用早期凋亡率分别为2.94±1.44%、3.48±2.18%、14.31±4.96%、41.09±9.82%,流式细胞检测结果显示NCI-H1975细胞在姜黄素、吉非替尼的联合作用下,较单用吉非替尼呈现出对肿瘤细胞更为明显的凋亡诱导效应(p0.05),提示姜黄素可以促进吉非替尼体外诱导NCI-H1975的凋亡。3.分别用lOng/ml浓度的姜黄素、8μmol/L浓度的吉非替尼及两药联用(姜黄素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)对NCI-H1975细胞作用24小时后,Western Blotting法检测EGFR下游MAPK途径中的P-P38、P-ERK1/2、P-NF-κB以及PI3K/AKT途径中的P-AKT蛋白表达水平。结果发现,姜黄素联合吉非替尼较单用吉非替尼或单用姜黄素可更显著抑制P38、ERK1/2、NF-κB、AKT的磷酸化水平。4.分别以lOng/ml浓度的姜黄素、8μmol/L浓度的吉非替尼及两药联用(姜黄素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)处理培养于甲基纤维素半固体培养皿中对数生长期的NCI-H1975细胞,CO2培养箱培养10天后,倒置显微镜下计数≥30个细胞的集落,计算克隆集落数,结果显示姜黄素(lOng/ml)±吉非替尼(8μmol/L)联合作用,较单用吉非替尼(8μmol/L)呈现出对肿瘤细胞克隆形成更为明显的抑制效应(p0.05),提示姜黄素可以提高吉非替尼对NCI-H1975克隆形成能力的抑制作用。5.分别以姜黄素lOng/ml、吉非替尼8μmol/L,及姜黄素10ng/ml+吉非替尼8μmol/L对肿瘤细胞NCI-H1975作用24小时,同时设立不加药为空白对照组,用鼠抗人抗P-gp-FITC单克隆抗体对药物处理后的细胞进行染色,然后流式细胞仪上机检测P糖蛋白(P-glycoproein, P-gp),结果显示单用姜黄素组及两药联用组P糖蛋白表达明显低于空白组(p0.05),提示姜黄素可下调P糖蛋白表达研究结论：1.姜黄素可显著降低NCI-H1975对吉非替尼的IC50,姜黄素降低NCI-H1975耐药性可能与降低肿瘤细胞表面P糖蛋白有关。2.姜黄素联合吉非替尼可显著提高吉非替尼对NCI-H1975细胞增殖抑制、阻碍克隆形成、诱导凋亡的作用。3.姜黄素提高吉非替尼对NCI-H1975细胞药理作用的分子机制可能为促进吉非替尼对EGFR下游MAPK及PI3K/AKT通路磷酸化水平的抑制作用。
【关键词】：非小细胞肺癌 姜黄素 吉非替尼 增殖抑制 细胞凋亡 NCI-H1975细胞 耐药
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 缩略语12-14
• 1 研究背景14-18
• 2 材料与方法18-23
• 2.1 研究对象18
• 2.2 主要试剂与仪器18-19
• 2.3 主要实验步骤19-22
• 2.4 统计学处理22-23
• 3 结果23-33
• 3.1 姜黄素联合吉非替尼可增强吉非替尼对NCI-H1975细胞的增殖抑制作用23-24
• 3.2 姜黄素联合吉非替尼可促进吉非替尼诱导NCI-H1975细胞凋亡24-26
• 3.3 姜黄素联合吉非替尼可增强吉非替尼对NCI-H1975细胞克隆集落形成抑制作用26-28
• 3.4 姜黄素联合吉非替尼可增强吉非替尼对NCI-H1975细胞多条信号通路活化的抑制28-30
• 3.5 姜黄素可下调NCI-H1975细胞P-gp的表达30-33
• 4 讨论33-38
• 5 结论38-39
• 参考文献39-43
• 综述43-55
• 参考文献50-55
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果55

【参考文献】

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本文编号：591991