肺肿瘤抑制基因GPRC5A在肺癌发生中的作用

发布时间：2017-07-30 13:14

  本文关键词：肺肿瘤抑制基因GPRC5A在肺癌发生中的作用

  更多相关文章： 肺癌 动物模型 G蛋白偶联受体C家族第5组成员A 表皮生长因子受体 信号转导及转录活化因子3

【摘要】：目的利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型,研究GPRC5A作用的分子机理及关键性靶向信号通路,揭示GPRC5A抑制肺癌发生的作用及生物学意义。材料与方法1.利用m RNA表达谱芯片分析比较野生型与Gprc5a基因敲除型小鼠气管上皮细胞(MTEC)的差异表达,用RT-PCR和Westernblot的方法分别在m RNA和蛋白质水平上验证。2.构建一系列GPRC5A截短体与缺失突变体,运用luciferase报告基因实验和Westernblot实验检测突变体质粒的功能活性,确定GPRC5A发挥抑制作用的功能结构域;运用免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验探究GPRC5A抑制EGFR信号通路的作用机制。3.利用EGFR及其他信号通路的特异性抑制剂,分别处理Gprc5a-/-小鼠肺气管上皮细胞,用CCK-8法检测不同药物对细胞增殖的抑制作用。4.利用Gprc5a基因敲除小鼠的肺癌模型,通过RT-PCR、Westernblot,检测Gprc5a-/-小鼠的肺组织中EGFR和STAT3信号通路是否有过度激活的情况。5.在人的肺癌细胞系中,构建GPRC5A的稳定表达株,验证GPRC5A在人肺癌细胞中是否也有抑制EGFR信号通路的作用;裸鼠皮下移植实验,研究GPRC5A对A549细胞在裸鼠皮下成瘤的影响。结果1.Affymetrix全基因组表达谱芯片结果表明,Gprc5a基因敲除小鼠MTEC细胞同野生型细胞相比,其EGFR信号通路发生显著增高。2.Gprc5a基因敲除小鼠MTEC细胞中p-EGFR和p-STAT3异常性高表达;HEK293T细胞中,GPRC5A的高表达能够抑制EGF诱导的EGFR-STAT3信号通路的过度激活。3.GPRC5A的跨膜结构域为抑制EGFR信号通路所必须;GPRC5A可与EGFR发生物理相互作用,该功能由其跨膜结构域所介导,二者在细胞膜上有共定位。4.Gprc5a-/-MTEC细胞对EGFR的3种抑制剂的敏感性都明显高于Gprc5a+/+MTEC,其他信号通路的抑制剂对这两种细胞增殖的抑制作用都相差不大。5.Gprc5a-/-小鼠的肺组织中p-EGFR和p-STAT3的表达明显高于Gprc5a+/+小鼠。6.在人的非小细胞肺癌细胞系H1975和A549中过表达GPRC5A能抑制EGF诱导的或持续性激活的p-EGFR和p-STAT3;过表达GPRC5A能够抑制A549细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。结论1.Gprc5a-/-MTEC中,EGFR-STAT3信号通路发生失控性增强,GPRC5A能够抑制EGFR-STAT3信号通路的过度激活。2.GPRC5A通过其跨膜结构域对EGFR发挥抑制作用;GPRC5A能够与EGFR发生直接或者间接的相互作用,该功能由其跨膜区域所介导。3.Gprc5a-/-小鼠MTEC细胞比野生型细胞更加依赖于EGFR信号通路。4.Gprc5a-/-小鼠的肺组织中EGFR和STAT3的信号通路是异常激活的。5.在人肺癌细胞系中高表达GPRC5A能够抑制其EGFR信号通路的过度激活和裸鼠皮下成瘤能力。
【关键词】：肺癌 动物模型 G蛋白偶联受体C家族第5组成员A 表皮生长因子受体 信号转导及转录活化因子3
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 缩略语表14-16
• 前言16-22
• 第一章 GPRC5A能够抑制EGFR-STAT3信号通路的过度激活22-44
• 1.1 材料与方法24-34
• 1.1.1 材料24-26
• 1.1.2 方法26-34
• 1.2 结果34-41
• 1.2.1 mRNA芯片分析比较野生型与Gprc5a基因敲除小鼠气管上皮细胞信号通路差异34-36
• 1.2.2 Gprc5a~(-/-) 小鼠气管上皮细胞中EGFR-STAT3信号通路是失调的36-39
• 1.2.3 GPRC5A的高表达能够抑制EGF诱导的EGFR-STAT3信号通路的过度激活39-41
• 1.3 讨论41-44
• 第二章 GPRC5A抑制EGFR信号通路的作用机制44-58
• 2.1 材料与方法45-50
• 2.1.1 材料45
• 2.1.2 方法45-50
• 2.2 结果50-56
• 2.2.1 GPRC5A的跨膜结构域对于其抑制EGFR的作用是必需的50-53
• 2.2.2 GPRC5A的跨膜结构域能够与EGFR发生物理的相互作用53-56
• 2.3 讨论56-58
• 第三章 GPRC5A~(-/-)小鼠体内EGFR- STAT3信号通路的异常激活58-70
• 3.1 材料与方法59-62
• 3.1.1 材料59-60
• 3.1.2 方法60-62
• 3.2 结果62-68
• 3.2.1 Gprc5a~(-/-)小鼠气管上皮细胞依赖于EGFR信号通路62-65
• 3.2.2 Gprc5a~(-/-)小鼠的肺组织中EGFR和STAT3的信号通路是异常激活的65-68
• 3.3 讨论68-70
• 第四章 高表达GPRC5A抑制人肺癌细胞系EGFR信号通路和其裸鼠体内成瘤能力70-77
• 4.1 材料与方法71-74
• 4.1.1 主要试剂和药品71
• 4.1.2 方法71-74
• 4.2 结果74-76
• 人肺癌细胞系中高表达GPRC5A能够抑制EGFR信号通路和裸鼠成瘤能力74-76
• 4.3 讨论76-77
• 全文结论77-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-86
• 攻读硕士学位期间已发表或待发表的论文86

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本文编号：594372