迷迭香酸对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤及warburg效应的影响

发布时间：2017-08-02 10:30

  本文关键词：迷迭香酸对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤及warburg效应的影响

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【摘要】：胃癌是常见的消化道肿瘤,致死率高,限于经济水平以及对疾病认识,我国的胃癌以进展期多见。胃癌的进展与胃癌细胞所在的微环境息息相关。肿瘤细胞的代谢方式与代谢产物在微环境的形成中起重要作用。肿瘤细胞在有氧条件下仍以产生较少ATP的糖酵解为主要代谢方式,这是肿瘤的重要特征之一,这种现象被称为Warburg效应。Warburg效应可以为肿瘤细胞快速供能,同时产生的中间代谢产物可用以合成蛋白质、核酸及脂类等生物大分子,为其自身生长和增殖提供必需的物质基础,在肿瘤细胞抗凋亡、增殖和肿瘤微环境形成和维持中发挥至关重要的作用。Warburg效应的主要表现为高葡萄糖消耗伴随高乳酸生成,肿瘤的warburg效应催生了氟脱氧葡萄糖正电子成像术(FDG-PET imaging),在临床上广泛应用于肿瘤检测,对于胃癌的术前分期敏感性及特异性较高,利用气相色谱-质谱分析法检测胃腺癌组织,发现与正常胃组织相比,胃癌组织中诸如丙酮酸、乳酸、酮体等之类的糖酵解产物均升高。使葡萄糖代谢在胃癌的诊疗过程中发挥着越来越大的作用。研究证实在保证机体能量需求的情况下,减少葡萄糖的摄入,可抑制肿瘤细胞Warburg效应,延缓肿瘤生长。抑制Warburg效应可阻止肿瘤细胞快速获能,同时减少用于合成代谢的中间产物。但是目前缺乏有效的Warburg效应抑制剂。近年来,中药抗肿瘤研究已取得了较大的进展并得到国际公认,我国药用植物资源丰富,有些药物已经表现出良好的应用前景。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是来源于唇形科植物迷迭香中的天然酚酸类化合物,由咖啡酸和3,4-二甲基苯基乳酸组成的酯类化合物,化学式为C18H1608,其水溶性好,广泛存在于唇形科、紫草科、伞形科、葫芦科和椴树科等多种植物中。具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血管生成等功能。在抗肿瘤方面,RA可抑制乳腺癌细胞的增殖,阻止其发生骨转移；RA可抑制白血病细胞增殖,改善急性髓细胞白血病血液学参数,延长生存期；RA可降低皮肤癌乳头状瘤数目、减轻肿瘤负荷；RA可抑制结肠癌细胞中ERK和Akt的磷酸化,阻断MAPK/ERK通路,诱导结肠癌细胞凋亡,阻止其转移。体外实验发现迷迭香酸可减少胃癌MKN-45细胞葡萄糖消耗,降低乳酸的生成,抑制其warburg效应,加速其凋亡。但是迷迭香酸在体内对胃癌的warburg效应影响尚不清楚,本研究旨在研究迷迭香酸在体内对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤的作用及其对warburg效应的影响,为进一步研究迷迭香酸对胃癌的影响奠定基础。目的：观察不同浓度迷迭香酸对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用,检测其对肿瘤组织的葡萄糖消耗、乳酸产生量的影响,分析迷迭香酸对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤warburg效应中关键酶己糖激酶-2和乳酸脱氢酶-A的影响,探讨迷迭香酸抑制裸鼠移植瘤生长及其对warburg效应可能的作用机制。方法：细胞培养于10%胎牛血清、0.1mg/mL链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、5%CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞用于裸鼠接种。将生长至对数期人胃癌细胞MKN451×109细胞悬液接种于24只裸鼠右侧腋窝外侧皮下。当荷瘤裸鼠生长1周,肿瘤体积约为(74.08±17.89)mm3时,将24只荷瘤鼠随机分为低剂量RA处理组、中剂量RA处理组、高剂量RA处理组、对照组4组,每组6只。处理组每次分别经腹腔注射0.2ml迷迭香酸,浓度依次为1mg/kg.2mg/kg.4mg/kg,空白组予等量生理盐水腹腔注射,每日处理2次,间隔12小时,每次给药时称量体重,按照体重变化调整给药剂量,连续处理18天,每3天用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径(a)和最小径(b),按照体积(V)=a×b2/2计算肿瘤的体积,以肿瘤体积变化对时间绘制生长曲线。经迷迭香酸处理后第19天将裸鼠麻醉后处死,剥离肿瘤称重,计算肿瘤抑制率(%),肿瘤抑制率%=(对照组肿瘤重量-给药组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100%。ELISA法测瘤组织匀浆中IL-6的含量,称取瘤组织重量,按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下2500转/分,离心10分钟后取上清液,取瘤组织上清液按照ELISA试剂盒说明书进行测量IL-6表达水平。葡萄糖、乳酸试剂盒法检测瘤组织匀浆中葡萄糖、乳酸的含量,取瘤组织上清液按照试剂盒说明书检测葡萄糖、乳酸含量。Rt-PCR检测IL-6 mRNA、STAT3 mRNA、HIF-lamRNA、HK-2 mRNA、LDHA mRNA的相对表达量,提取瘤组织中的总RNA,测定样本A260/A280和样本浓度。逆转录合成cDNA,由上海生工生物工程有限公司设计并合成HK-2、LDHA及内参β-actin引物,按照天根公司SuperReal PreMix Plus试剂盒说明书,通过Bio-Rad公司PCR仪器(7500)SYBR Green分析法进行荧光定量PCR检测,反应条件：95℃ 15min; 95℃ 10s,60℃ 60s,40个循环；95℃ 15s,55℃ 45s, 95℃ 15s。最后以2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。Western blotting检测STAT3 α、pSTAT-3α、HIF-1α、HK-2、LDHA蛋白的表达,提取组织中的总蛋白,BCA法测定蛋白含量后,经变性、电泳、转膜、一抗4℃过夜、二抗孵室温育1小时、洗膜后避光孵育5分钟,显影采图后采用Quantity one图像处理软件分析经不同浓度迷迭香酸作用后移植瘤中STAT3 α、pSTAT-3α、HIF-1α、HK-2、LDHA的表达情况的表达变化。所有实验数据处理统一使用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。各组间肿瘤生长抑制率比较用卡方检验,计量资料用均数±标准差(f±s)表示,多组均数间比较用单因素方差分析,P0.05差异有统计学意义。结果：裸鼠移植瘤生长情况,接种后所有荷瘤鼠接种部位均可见圆形小皮丘,接种第7天所有荷瘤鼠接种部位均出现(74.08±17.89)mm3结节,结节边缘形状多不规则,触之质中偏韧,活动度尚可。各组裸鼠皮下结节大小差异无统计学意义(F=0.644,P=0.595),人胃癌MKN45细胞的裸鼠移植瘤模型建立成功,成瘤率100%。对照组与低、中剂量迷迭香酸处理组的裸鼠饮食、活动及生长均良好,但高剂量组裸鼠体重下降较快,在一定剂量范围内,迷迭香酸干预实验对裸鼠无明显的行为学改变。对照组中移植瘤生长较快,经迷迭香酸处理后生长较为缓慢。在经过迷迭香酸处理12天后,移植瘤体积均小于对照组,差异具有统计学意义(F=137.34,P=0.000)。迷迭香酸能够抑制裸鼠移植瘤的生长,且随着剂量增大,抑制效应越明显。给药结束后,处死荷瘤鼠,取瘤称重。迷迭香酸各个剂量组的肿瘤重量均低于对照组,且抑制率均随着迷迭香酸的剂量增大而上升,呈浓度依赖性。随着迷迭香酸剂量加大,低、中、高剂量组的平均瘤重分别为(169.86±8.97)mg、(159.82±6.91)mg、(144.11±4.29) mg,低于对照组的瘤重(190.34±5.23)mg(F=51.592,P0.05),抑瘤率分别为10.76%、16.03%、24.29%。葡萄糖、乳酸试剂盒结果显示,经迷迭香酸处理后,移植瘤组织匀浆中葡萄糖的相对含量与对照组相比升高,差异具有统计学意义(F=5.302,P=0.026)。经迷迭香酸处理后瘤组织匀浆中的乳酸相对含量较对照组降低,差异具有统计学意义(F=8.140,P=0.008)。ELISA结果显示经迷迭香酸作用后,瘤组织匀浆中IL-6的相对分泌量与对照组相比减少,且差异具有统计学意义(F=8.140,P=0.008)。Rt-PCR结果显示,经迷迭香酸处理后各移植瘤组织匀浆中IL-6 mRNA.STAT3 mRNA.HIF-1α mRNA、HK-2 mRNA、LDHA mRNA水平相对表达量低于对照组(均P0.05)。western blotting结果显示,与对照组相比,经不同剂量迷迭香酸处理后,移植瘤组织匀浆中TAT3α表达降低(F=39.630,P0.001),STAT-3α磷酸化后活化后形成pY705-STAT3 a的表达量也因迷迭香酸作用后表达降低(F=37.645,P0.001)。移植瘤组织中糖酵解途径中起“限流作用”的HK-2表达下调(F=51.454,P0.001),HK-2可催化葡萄糖和ATP形成6-磷酸葡萄糖,且此反应不可逆。LDHA表达也下调(F=25.273,P0.001),LDHA促进丙酮酸转化为乳酸。移植瘤组织中作为联系warburg效应、缺氧、炎症反应等的枢纽HIF-1α表达也因谜底香酸的作用而表达下调(F=27.058,P0.001)。结论：迷迭香酸可减少肿瘤组织对葡萄糖的消耗、降低肿瘤组织中乳酸的产生量,抑制胃癌组织中肿瘤细胞的Warburg效应,同时抑制胃癌移植瘤生长。可能与迷迭香酸可降低肿瘤微环境中的IL-6含量,减少STAT-3α活化,抑制胃癌移植瘤组织糖酵解过程中的LDHA等关键酶的表达等有关。
【关键词】：胃癌 Warburg效应 迷迭香酸 白介素-6
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 胃癌的代谢变化14-15
• 1.2 缺氧对胃癌葡萄糖代谢的影响15-17
• 1.3 乳酸对肿瘤微环境的影响17-19
• 1.4 迷迭香酸对炎症与肿瘤的影响19-23
• 第二章 迷迭香酸对人胃癌MKN-45细胞裸鼠移植瘤及warburg效应的影响23-55
• 2.1 材料23-24
• 2.2 方法24-38
• 2.3 结果38-45
• 2.4 讨论45-54
• 2.5 总结54-55
• 参考文献55-59
• 综述59-74
• 参考文献70-74
• 攻读硕士学位期间成果74-75
• 致谢75-76

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本文编号：608841