胰腺癌Foxp3阳性肿瘤细胞对Treg趋化现象的研究

发布时间：2017-08-03 04:03

  本文关键词：胰腺癌Foxp3阳性肿瘤细胞对Treg趋化现象的研究

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【摘要】：目的胰腺癌是目前恶性程度较高的肿瘤之一,导管腺癌是其最常见的病理类型,约90%胰腺癌为胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC),大约60%的胰腺癌患者在确定诊断时已发生远处转移,25%患者为局部晚期,不能行根治性切除术,中位生存期仅为6~9个月,不可手术切除的患者5年总体生存率不足5%。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系,这个环境称为肿瘤微环境,具体是指肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞共同构成的局部内环境。免疫细胞做为肿瘤微环境的重要组成部分,正日益受到人们的重视。调节性T细胞(Regulatory cell,Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,其在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用。Treg细胞特征性表达CD4+CD25+Foxp3+。另外转录因子Foxp3不仅能作为CD4+CD25+Treg的标志分子,还是决定CD4+CD25+Treg功能的关键基因。结合文献和我们的前期实验发现胰腺导管腺癌与正常胰腺组织相比,表达较高的Foxp3。而且我们发现在Foxp3表达较高的组织标本中,Treg浸润同样较多。以上的发现使我们推测,导管腺癌细胞也许可以通过自身表达Foxp3,启动某些基因的表达,通过一些信号通路或事件,趋化血循环的Treg细胞进入肿瘤微环境中,发挥免疫抑制效应,介导病人的不良预后。本实验作为Foxp3对Treg趋化现象和机制探究的前期研究基础,重点放在Foxp3的临床意义,病人标本中Foxp3对Treg的趋化现象,体外实验Foxp3对Treg的趋化现象,以及构建Foxp3过表达质粒和稳转细胞系,为本课题组后续实验打下坚实基础。方法一、肿瘤细胞Foxp3的表达、Treg数与病人预后的关系,及其与肿瘤微环境中Treg浸润的相关性1.利用免疫组化方法检测正常胰腺组织和多种胰腺肿瘤组织Foxp3表达,探讨胰腺导管腺癌Foxp3表达与病人预后的关系。2.利用免疫组化方法检测导管腺癌肿瘤微环境中Treg浸润情况,并分析其与病人预后的关系。3.利用Spearman相关性分析同一病人肿瘤组织Foxp3表达与周围Treg浸润是否有统计学联系。二、人源Foxp3过表达质粒、人源Foxp3过表达稳转细胞系、鼠源Foxp3干扰稳转细胞系的建立及验证1.利用基因工程技术,将人源Foxp3蛋白编码区连接到瞬转载体和慢病毒载体。2.利用Ca Cl2转染293T细胞产生病毒液,并用三包装体系感染目的细胞,构建稳转细胞系。3.购买鼠源Sh Foxp3载体,利用三包装体系感染鼠源胰腺癌细胞系,构建稳定敲除Foxp3的稳转细胞。4.分别用Realtime PCR的方法和Western Blot检测瞬转及稳转细胞系的效果。三、体外胰腺癌细胞系对Treg细胞的趋化1.利用稳转细胞系,或瞬转技术及小干扰RNA技术,获得胰腺癌细胞系过表达或干扰Foxp3的上清液。2.利用ficoll密度梯度离心法从新生儿脐带血中,获得数量较多的淋巴细胞,并用磁珠的方法,分离出CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。3.利用Transwell小室,验证各种不同的胰腺癌细胞培养上清液对Treg的趋化作用。结果在胰腺导管腺癌组织中,肿瘤细胞Foxp3的表达明显增高,Foxp3的表达程度与病人标本组织学分化有统计学联系,而且Foxp3的表达程度与病人的总生存期和无复发生存亦存在统计学联系。胰腺导管腺癌肿瘤微环境中存在Treg细胞的表达,其表达量与病人的总生存期和无复发生存存在统计学联系。利用Spearman相关性分析肿瘤组织中Foxp3的表达与周围Treg浸润存在相关性。通过测序分析,成功构建Foxp3过表达质粒和慢病毒质粒,利用Realtime PCR和Western Blot验证瞬转和构建稳系的效果,发现Foxp3可以明显的上调或下调,稳系构建成功,为本课题后续体外实验和动物实验奠定了基础。经ficoll密度梯度离心及磁珠的方法,经流式检测,可以分离出的足量的Treg细胞保证后续实验的使用。利用transwell趋化实验证明,无论是瞬转过表达质粒还是稳转细胞系,过表达Foxp3的胰腺癌细胞上清培养液对Treg趋化作用明显增强,而干扰Foxp3的胰腺癌细胞上清培养液对Treg趋化作用明显减弱。差异有统计学意义。结论胰腺导管腺癌高表达Foxp3,且与病人总生存期和无复发生存期相关,Foxp3表达与Treg的浸润存在统计联系,提示肿瘤细胞Foxp3可能对Treg存在某种趋化作用。在构建过表达质粒和稳转细胞系的基础上,趋化实验表明Foxp3对于纯化出来的Treg确实存在趋化作用。
【关键词】：胰腺导管腺癌 Foxp3 Treg 趋化
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、肿瘤细胞Foxp3表达与Treg浸润间的关系16-26
• 1.1 对象和方法16-18
• 1.1.1 实验对象16-17
• 1.1.2 实验方法17-18
• 1.2 结果18-24
• 1.2.1 正常胰腺及不同胰腺肿瘤Foxp3的表达18-19
• 1.2.2 导管腺癌Foxp3表达情况及其与病人生存期相关性分析19-20
• 1.2.3 导管腺癌肿瘤微环境中Treg表达情况及其与病人生存期相关性分析20
• 1.2.4 导管腺癌Foxp3表达情况及其与临床病理特征之间的联系20-21
• 1.2.5 导管腺癌Foxp3表达情况及肿瘤微环境中Treg浸润与病人预后的单因素及多因素分析21-22
• 1.2.6 导管腺癌Foxp3表达情况与肿瘤微环境中Treg浸润相关性检验22-24
• 1.3 讨论24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、Foxp3过表达质粒和稳转细胞系的构建26-44
• 2.1 对象和方法26-37
• 2.1.1 实验对象26-30
• 2.1.2 实验方法30-37
• 2.2 结果37-42
• 2.2.1 人源Foxp3 CDS区序列及PCR扩增结果37-39
• 2.2.2 Foxp3 CDS区序列与T载体连接，酶切鉴定，及测序39-40
• 2.2.3 酶切T1-Foxp3，并与目的载体连接，酶切鉴定，及测序40-41
• 2.2.4 人源过表达Foxp3稳转细胞系和鼠源干扰Foxp3稳转细胞系的验证41-42
• 2.3 讨论42-43
• 2.4 小结43-44
• 三、体外胰腺癌细胞系对Treg细胞的趋化44-52
• 3.1 对象和方法44-47
• 3.1.1 实验对象44
• 3.1.2 实验方法44-47
• 3.2 结果47-51
• 3.2.1 不同细胞系过表达或干扰Foxp3效果验证47-48
• 3.2.2 Treg细胞的纯化48-49
• 3.2.3 不同细胞系过表达或干扰Foxp3与对照组相比，，对Treg细胞的趋化作用49-51
• 3.3 讨论51
• 3.4 小结51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-56
• 发表论文和参加科研情况说明56-57
• 综述 Foxp3、Foxp3+Treg细胞在肿瘤中的研究进展57-67
• 综述参考文献62-67
• 致谢67-68

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本文编号：612513