小分子TRKs抑制剂对胶质瘤细胞生物学行为的影响

发布时间：2017-08-05 11:32

  本文关键词：小分子TRKs抑制剂对胶质瘤细胞生物学行为的影响

  更多相关文章： 原肌球蛋白受体激酶(TRKs)抑制剂 抗肿瘤 分子靶向治疗

【摘要】：背景:胶质瘤是威胁人类健康和生命的重大疾病,由于其较高的致死率,抗胶质瘤药物的研究一直是肿瘤治疗研究的难点,而新型抗肿瘤药物因其特异性高且毒副作用小更是备受关注。分子靶向治疗是通过靶向抑制肿瘤发生发展的重要信号通路来阻止肿瘤细胞的生长并降低对正常细胞的毒性。原肌球蛋白受体激酶家族(tropomyosin receptor kinase,TRKs)是酪氨酸激酶家族的一员,是神经生长因子受体。其与神经生长因子结合后可以激活细胞内包括PI3K/AKT/m TOR、MAPK/ERK等在内的一系列信号通路级联反应,进而引起细胞表型转变。原肌球蛋白受体激酶抑制剂在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用。有报道称TRKs家族在胶质瘤细胞中表达异常,是治疗胶质瘤的潜在靶点。目的:对新合成的原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase,TRKs)抑制剂进行初步的活性筛选,进一步探讨候选化合物对胶质瘤细胞生物学行为产生影响的分子机理。方法:用不同浓度TRKs抑制剂处理细胞,通过胶质瘤U251、U87细胞及人脐带血上皮细胞HUVEC的增殖实验对合成的原肌球蛋白受体激酶抑制剂进行初步的药物活性筛选,分析并筛选出抗肿瘤活性高、细胞毒性低的候选化合物。选取抗肿瘤增殖活性较好的化合物采用ADP-Glo Kinase Assay的方法对其做进一步TRKA激酶抑制活性的评价。采用细胞化学染色法分析细胞形态学和凋亡的变化;克隆形成实验观察TRKs抑制剂对肿瘤增殖能力的影响;用候选化合物处理胶质瘤细胞,Hoechst33258/PI双染及TUNEL染色法检测其细胞死亡及DNA断裂情况,流式细胞术检测细胞周期分布及早期凋亡AnnexinⅤ-FITC水平的变化;Western Blot分析药物处理后胶质瘤细胞内抗凋亡蛋白(pro-Caspase3、Bcl-2)、凋亡蛋白(BAD)及AKT磷酸化水平,初步探讨抗肿瘤机制。结果:成功筛选出特异性好、抗肿瘤活性高的化合物,并评价了其对TRKA激酶的抑制活性。细胞增殖实验及克隆形成实验表明TRKs抑制剂候选化合物(6号化合物)能显著抑制胶质瘤细胞的增殖,在浓度约为9μM时抑制率达到50%,且对正常细胞的毒副作用低于阳性对照组;Hoechst33258/PI双染及TUNEL染色法分析发现胶质瘤细胞出现明显的凋亡特征:胞质皱缩,核膜裂解、边缘化,DNA断裂等;流式检测AnnexinⅤ-FITC的水平及细胞周期分布的结果表明此化合物可以阻滞胶质瘤的细胞周期、促进凋亡蛋白的表达,随后的Western Blot分析也证实了候选化合物处理后,抗凋亡蛋白pro-Caspase3和Bcl-2的表达降低,凋亡蛋白BAD的表达显著升高,而TRKs受体介导的下游信号通路AKT磷酸化水平降低,提示6号候选化合物有可能是通过抑制AKT介导的下游信号通路途径来发挥抗肿瘤作用的。结论:6号化合物是一种特异性好、抗肿瘤活性较高的小分子TRKs抑制剂,通过抑制TRKs激酶活性,调节PI3K-AKT信号通路、降低AKT的磷酸化水平,进而抑制抗凋亡蛋白表达水平并增加促凋亡蛋白表达水平,最终阻滞细胞周期、促进细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。研究结果有望为临床治疗胶质瘤提供新的思路。
【关键词】：原肌球蛋白受体激酶(TRKs)抑制剂 抗肿瘤 分子靶向治疗
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-14
• 第一章 原肌球蛋白受体激酶抑制剂抗肿瘤活性的筛选14-29
• 一、实验材料14-15
• 1.1 细胞和药物14
• 1.2 主要仪器与试剂14-15
• 1.3 试剂的配制15
• 二、实验方法15-21
• 2.1 细胞培养与传代15-16
• 2.2 化合物的设计合成16-19
• 2.3 TRKs抑制剂抗肿瘤活性的筛选19
• 2.4 TRKA激酶抑制活性的筛选19-21
• 2.5 统计学分析21
• 三、实验结果21-27
• 3.1 MTT法检测12个TRKs抑制剂及阳性对照药对胶质瘤细胞生长的影响21-24
• 3.2 TRKs抑制剂对TRKA激酶的抑制活性影响24-27
• 四、讨论27-29
• 第二章 候选化合物对胶质瘤增殖作用的影响29-38
• 一、实验材料29-30
• 1.1 细胞和药物29
• 1.2 主要仪器与试剂29-30
• 1.3 试剂的配制30
• 二、实验方法30-31
• 2.1 细胞化学染色法分析候选化合物对细胞活力的影响30
• 2.2 MTT检测细胞增殖30-31
• 2.3 克隆形成实验31
• 2.4 候选化合物干预细胞后对周期分布的影响31
• 2.5 统计学分析31
• 三、实验结果31-36
• 3.1 候选化合物对细胞形态的影响31-32
• 3.2 MTT检测候选化合物对细胞增殖的影响32-33
• 3.3 克隆形成实验33-34
• 3.4 药物处理后对细胞周期的影响34-36
• 四、讨论36-38
• 第三章 候选化合物对U251胶质瘤凋亡作用的研究38-52
• 一、实验材料38-40
• 1.1 细胞和药物38
• 1.2 主要仪器与试剂38-39
• 1.3 试剂配制39-40
• 二、实验方法40-44
• 2.1 Hoechst33258及PI双染色观察细胞凋亡变化40
• 2.2 AnnexinⅤ-FITC凋亡检测40-41
• 2.3 TUNEL检测细胞DNA断裂41
• 2.4 Western Blot检测凋亡蛋白41-44
• 2.5 统计学分析44
• 三、实验结果44-48
• 3.1 Hoechst33258及PI双染观察U251细胞的形态学变化44-45
• 3.2 AnnexinⅤ-FITC标记检测候选化合物处理的U251细胞凋亡45-46
• 3.3 TUNEL检测候选化合物作用后U251细胞DNA断裂情况46-47
• 3.4 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平47-48
• 四、讨论48-52
• 第四章 总结52-53
• 参考文献53-59
• 个人简历59-62
• 致谢62

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