短肽GMBP1通过GRP78逆转胃癌耐药的分子机制

发布时间：2017-08-06 14:00

  本文关键词：短肽GMBP1通过GRP78逆转胃癌耐药的分子机制

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【摘要】：【背景】胃癌发病率居世界恶性肿瘤第四位,死亡率居第二位,严重威胁着人类的健康和生命[1]。化疗是进展期胃癌治疗的主要手段之一,然而多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象的产生大大降低了化疗效果,目前已知的许多MDR相关分子机制仍不能完全解释胃癌MDR现象。因此,进一步探索MDR分子机制,寻找新的胃癌耐药相关分子及信号通路对逆转胃癌MDR具有重要意义。本课题组利用噬菌体表面展示肽库技术(phage display techniques),以胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR为阳性细胞,以结合能力为标准,采用生物淘选(biopanning)的方法,并通过药物敏感实验进行功能学筛选,获得了能够特异结合于胃癌耐药细胞、逆转胃癌MDR表型的系列短肽BMBPs(Gastric Multidrug-resistant Binding Peptides,BMBPs)。GMBP1是其中的一种,它能与多种胃癌耐药细胞特异性结合,具有逆转胃癌耐药的活性,并通过蛋白质组学方法进一步筛选并鉴定GMBP1结合受体为GRP78,研究发现GMBP1与GRP78结合后能够发生内化,但GMBP1与GRP78结合是否引起信号通路的活化或抑制,它是如何发生内化、内化后的亚细胞定位、是否激活新的信号通路,这些机制尚不清楚。因此,本课题拟通过流式细胞技术、si RNA技术及激光共聚焦显微镜等方法,研究GMBP1细胞内化的亚细胞定位及其机制;采用蛋白质组学技术及生物信息学方法分析GRP78介导GMBP1逆转耐药的关键分子。本研究旨在阐明GMBP1逆转胃癌耐药的分子机制,有望为胃癌耐药逆转治疗提供新方法。【目的】1.鉴定GMBP1及其受体GRP78亚细胞定位及GMBP1内化入细胞的机制。2.阐明GMBP1通过GRP78逆转胃癌耐药的分子机制,为胃癌耐药逆转治疗提供实验依据及可能的候选分子。【方法】1.通过免疫荧光和流式细胞技术分析短肽GMBP1及其受体GRP78在胃癌耐药细胞的结合靶点亚细胞定位。2.通过si RNA技术建立低表达GRP78的胃癌细胞系(si GRP78-SGC7901/ADR和si GRP78-SGC7901/VCR),利用Western blot和RT-PCR验证转染效率。3.通过免疫荧光技术验证短肽GMBP1进入胃癌耐药细胞是否是其受体GRP78介导引起的内化。4.选取经典的发生细胞内化的相关分子转铁蛋白,用荧光素标记,通过激光共聚焦分析与FITC-GMBP1共定位情况,揭示其内化途径。选取针对转铁蛋白内化途径的特异性抑制剂氯丙嗪,通过免疫荧光实验观察短肽FITC-GMBP1的内化能否被抑制,进一步证实短肽是通过该途径发生的内化。5.采用同位素标记差异蛋白定量分析(i TRAQ)技术,对短肽GMBP1作用胃癌耐药细胞的差异表达蛋白进行筛选。6.对筛选出来的差异蛋白进行生物信息学分析,即GO分类分析和KEGG信号通路分析,预测差异蛋白所参与的信号通路。7.通过Western blot技术验证筛选获得的差异蛋白在GMBP1作用前后耐药细胞中的表达情况。8.通过Western blot技术检测短肽GMBP1作用耐药细胞后差异蛋白、受体GRP78、耐药和凋亡相关分子的表达情况,初步分析GMBP1及其受体在胃癌多药耐药中的作用机制,为胃癌耐药逆转治疗提供新方法。【结果】1.短肽GMBP1内化入耐药细胞的机制1)免疫荧光实验结果证实,GRP78定位于耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胞膜和核周胞浆。2)流式细胞结果显示,FITC-GMBP1与耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR结合后的平均荧光强度高于对照肽FITC-URP,这表明GMBP1与其受体结合后可内化入耐药细胞。3)Western blot和RT-PCR结果证明,GRP78特异性小干扰RNA转染后可有效降低胃癌耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中GRP78蛋白和m RNA的表达(P0.01)。4)免疫荧光实验结果显示,特异性下调GRP78表达后,FITC-GMBP1在耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR内的荧光强度较对照组明显减弱,初步证实短肽GMBP1进入细胞是其受体GRP78介导的内化。5)激光共聚焦实验结果显示,FITC-GMBP1(绿色荧光)与Alexa Fluor(AF)-594(红色荧光)标记的转铁蛋白共定位于胞浆内(黄色荧光),氯丙嗪抑制转铁蛋白功能后,FITC-GMBP1内化荧光明显减弱,证实GRP78介导短肽GMBP1内化入耐药细胞可能是通过转铁蛋白途径发生的。2.短肽GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白的筛选1)对短肽GMBP1作用前后两个胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后的蛋白进行i TRAQ筛选,在GMBP1作用后,SGC7901/ADR共鉴定出3752个蛋白,SGC7901/VCR共鉴定出3749个蛋白质。将GMBP1作用后的蛋白表达差异倍数小于0.8倍,p值小于0.05的蛋白定义为下调蛋白,蛋白表达差异倍数大于1.5倍,p值小于0.05的蛋白定义为上调蛋白,我们获得了一组胃癌多药耐药相关蛋白。在GMBP1作用SGC7901/ADR细胞系后,发现共有95个上调蛋白和48个下调蛋白;在GMBP1作用SGC7901/VCR细胞系后,发现共有129个上调蛋白和88个下调蛋白。其中发现EIF4E和CTBP2在两个细胞系共同下调。2)运用生物信息学技术对筛选得到的蛋白进行GO分类分析和KEGG通路分析。GO分析从细胞成分(cellular components,CC)、生物学途径(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)三方面进行注释。KEGG分析显示,短肽GMBP1作用于SGC7901/ADR细胞后差异蛋白参与了38条KEGG通路,短肽GMBP1作用于SGC7901/VCR细胞后差异蛋白参与了79条KEGG通路。我们对这些通路进行富集分析,将前十条显著富集的KEGG进行整理,结果发现EIF4E和CTBP2在GMBP1作用于两个细胞系后均下调,并且发现CTBP2参与了Wnt信号通路,差异蛋白EIF4E是PI3K/Akt信号通路的下游分子。3.短肽GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白的鉴定及其在胃癌耐药中的作用机制1)Western blot结果显示,EIF4E和CTBP2在两个胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR均高表(P0.01),GMBP1作用耐药细胞后,EIF4E和CTBP2表达均下降,结果与i TRAQ结果一致。2)Western blot结果显示,GMBP1作用耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后,GRP78、MDR1、Bcl-2的表达水平明显降低,而Bax的表达增高。【结论】1.短肽GMBP1与其受体GRP78特异性结合后定位于胞浆及胞膜,GMBP1内化入耐药细胞是其受体GRP78介导、通过经典的转铁蛋白途径发生的。2.通过i TRAQ技术结合生物信息学分析,完成胃癌多药耐药相关蛋白高通量筛选,获得一组GMBP1作用耐药细胞后差异表达蛋白分子。其中,GMBP1作用SGC7901/ADR细胞系后,上调蛋白95个,下调蛋白48个;GMBP1作用SGC7901/VCR细胞系后,上调蛋白129个,下调蛋白88个。候选分子EIF4E和CTBP2在多种耐药细胞中表达变化一致,可能发挥关键作用。3.GMBP1作用耐药细胞后,EIF4E、MDR1表达明显降低,Bcl-2/Bax比值下降。因此推测,GMBP1与膜转位GRP78结合,通过阻断AKT/PI3K信号通路而下调EIF4E表达,直接或间接降低MDR1的表达和Bcl-2/Bax的比例,从而逆转胃癌多药耐药。其具体机制尚需进一步深入研究。
【关键词】：胃癌 多药耐药 GMBP1短肽 葡萄糖调节蛋白GRP78 iTRAQ
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-18
• 文献回顾18-41
• 第一部分GMBP1-GRP78复合物内化入耐药细胞及其机制研究41-59
• 引言41
• 1 材料41-44
• 1.1 细胞株41-42
• 1.2 主要试剂及仪器42-44
• 2 方法44-51
• 2.1 细胞培养44-45
• 2.2 免疫荧光检测GRP78在耐药细胞的荧光定位45-46
• 2.3 流式细胞技术检测FITC-GMBP1与耐药细胞的结合能力46
• 2.4 细胞转染46-47
• 2.5 细胞总蛋白样品制备47
• 2.6 Western blot方法检测转染后的细胞中GRP78蛋白质的表达量47-48
• 2.7 RT-PCR方法检测转染后的细胞中GRP78 m RNA的表达量48-50
• 2.8 免疫荧光观察下调GRP78表达后GMBP1内化入耐药细胞的变化50
• 2.9 激光共聚焦观察GMBP1内化机制50
• 2.10 干预实验50-51
• 2.11 统计学处理51
• 3 结果51-57
• 3.1 免疫荧光观察GRP78在胃癌耐药细胞的亚细胞定位51-52
• 3.2 流式细胞分析结果52-53
• 3.3 Western blot方法及RT-PCR方法检测转染效率53-54
• 3.4 下调GRP78表达后短肽GMBP1内化入耐药细胞的变化54-55
• 3.5 激光共聚焦技术研究GMBP1内化入细胞的机制55-57
• 4 讨论57-59
• 第二部分 基于ITRAQ技术筛选GMBP1作用胃癌耐药细胞后多药耐药相关蛋白59-71
• 引言59-60
• 1 材料60-61
• 1.1 细胞系60
• 1.2 主要试剂和耗材60
• 1.3 主要仪器设备60-61
• 2 方法61-63
• 2.1 细胞培养61
• 2.2 i TRAQ蛋白质提取和定量61-62
• 2.3 丙酮沉淀62
• 2.4 半胱氨酸封闭62
• 2.5 蛋白质酶解62
• 2.6 i TRAQ试剂进行标记62-63
• 2.7 肽段分离和鉴定63
• 2.8 生物信息学分析63
• 3 结果63-68
• 3.1 差异蛋白的蛋白质组学分析63-65
• 3.2 差异蛋白质GO功能聚类分析65-67
• 3.3 差异蛋白质的KEGG信号通路分析67-68
• 4 讨论68-71
• 第三部分 初步探讨GMBP1及其受体GRP78逆转胃癌耐药的分子机制71-79
• 引言71
• 1 材料71-73
• 1.1 细胞株71
• 1.2 主要试剂及仪器71-73
• 2 方法73-74
• 2.1 细胞培养73
• 2.2 Western blot蛋白质提取和定量73
• 2.3 Western blot检测差异蛋白的表达水平及耐药和凋亡相关分子表达73-74
• 3 结果74-76
• 3.1 GMBP1作用耐药细胞后差异蛋白EIF4E和CTBP2表达水平的鉴定74-75
• 3.2 GMBP1作用耐药细胞后GRP78、MDR1及凋亡相关分子的表达情况 ..· 704 讨论75-76
• 4 讨论76-79
• 小结79-80
• 参考文献80-94
• 附录94-106
• 附录 194-98
• 附录 298-104
• 附录 3104-105
• 附录 4105-106
• 个人简历和研究成果106-108
• 致谢108

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李远;向姣;张莎莎;刘北忠;龚放;彭明清;;微流控芯片技术分析细胞外酸性环境对肿瘤细胞P-糖蛋白表达、活性及其介导的道诺霉素细胞毒性的影响[J];中国医学科学院学报;2015年01期

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本文编号：630087