HtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究

发布时间：2017-08-10 01:26

  本文关键词：HtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究

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【摘要】：目的:对肝细胞癌中Htr A1丝氨酸蛋白酶(Htr A1 serine protease)表达量和肝癌细胞化疗敏感性之间的关系进行研究,同时探讨Htr A1丝氨酸蛋白酶的作用机制。方法:使用阿霉素(adriamycin,ADM)诱导出耐药肝癌细胞株Hep G2/ADM,MTT法检测耐药细胞株Hep G2/ADM对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)、奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)、阿霉素(adriamycin,ADM)和长春新碱(vincristine,VC R)的化疗敏感性,计算耐药指数(resistance index,RI)。Western blot方法检测Hep G2/ADM细胞中Htr A1丝氨酸蛋白酶、多药耐药P糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)以及多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated proteins,MRP1)的表达情况。限制性内切酶Bam HI和Eco RI构建真核表达载体p EGFP-N1-Htr A1,然后用p EGFP-N1-Htr A1对肝癌细胞株Hep G2/ADM进行转染。MTT检测高表达Htr A1丝氨酸蛋白酶的Hep G2/ADM肝癌细胞对5-Fu、ADM、MMC、L-0HP、VCR的化疗敏感性,计算RI,以观察Htr A1丝氨酸蛋白酶的高表达对肝癌细胞耐药的影响,采用加入不同浓度的Htr A1抑制剂NVP-LEB748的Hep G2/ADM细胞作为对照。为进一步研究Htr A1丝氨酸蛋白酶的作用机制,通过western blot检测多药耐药P-gp、MRP1和X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)在Htr A1高表达以及分别加入不同浓度NVP-LEB748的Hep G2/ADM肝癌细胞中的表达情况,通过XIAPsi RNA抑制其表达后,检测Htr A1高表达的Hep G2/ADM细胞对不同化疗药物的化疗耐药的情况,采用活性检测试剂盒对细胞凋亡蛋白酶--天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、7和9(aspartate-specific cysteine proteases 3、7和9,Caspase-3,Caspase-7,Caspase-9)的活性进行分析。结果:成功构建了肝癌耐药细胞株Hep G2/ADM,细胞中Htr A1的表达水平明显降低。真核表达载体p EGFP-N1-Htr A1转染Hep G2/ADM细胞后,细胞中Htr A1呈明显的高表达状态,Htr A1高表达的Hep G2/ADM细胞的化疗敏感性增强,肝癌细胞中Htr A1的表达和耐药指数(Resistance index,RI)成负相关。Western blot发现,不论有无Htr A1抑制剂的存在,P-gp和MRP1的表达水平并没有显著的变化,然而,XIAP的表达却随着Htr A1抑制剂浓度的升高而升高。通过RNA干扰后,XIAP的低表达导致RI的低水平,XIAP的表达和Hep G2细胞的化疗敏感性之间为负相关关系,另外,随着抑制剂浓度的增高,caspases 3、7和9的活性也明显降低。结论:Htr A1的高表达可以逆转肝癌细胞的多药耐药,其通过XIAP途径来提高肝癌细胞的化疗敏感性,Htr A1可能能够作为肝癌化疗的一个靶点。
【关键词】：HtrA1丝氨酸蛋白酶 肝细胞癌 化疗耐药 化疗敏感性 X连锁凋亡抑制蛋白
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 材料和方法11-24
• 结果24-29
• 讨论29-31
• 结论31-32
• 参考文献32-35
• 综述35-45
• 参考文献40-45
• 在读期间发表论文45-46
• 攻读学位期间本人获奖情况46-47
• 中英文缩写词表47-48
• 致谢48-49

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本文编号：648256