VPA促进冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡的作用及机制研究

发布时间：2017-08-10 01:27

  本文关键词：VPA促进冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡的作用及机制研究

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【摘要】：背景冬凌草甲素(oridonin,ORI)是从传统中药冬凌草中提取出来的四环二萜类天然有机化合物,是冬凌草中发挥作用的主要成分,具有抗炎、抗病毒和免疫调节等多种生物学功能,近年来,研究表明冬凌草甲素能抑制乳腺癌、宫颈癌、肝癌等多种肿瘤细胞的生长,也能抑制急性白血病的恶化,是一种理想的治疗急性白血病的药物。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)能抑制组蛋白脱乙酰酶,增加组蛋白过乙酰化导致染色体重组、细胞周期停滞、诱导细胞分化和凋亡等一系列生物学作用。研究表明,VPA作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,单独或者与其他药物联合作用可以通过诱导细胞凋亡发挥抗白血病的作用。为了增强中药ORI疗效同时降低化疗药物VPA副作用,本研究将小剂量ORI和VPA进行联合用药,观察他们对急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制,为临床治疗急性早幼粒白血病提供新方案打下实验基础。目的探讨VPA与冬凌草甲素(oridonin,ORI)联合诱导HL-60细胞凋亡的作用及其机制。方法CCK-8法选取ORI和VPA最佳协同作用剂量;VPA和ORI单独或联合作用于HL-60细胞后光学显微镜下观察细胞形态学变化以及Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察细胞核形态学变化;AnnexinV/PI试剂盒检测HL-60细胞凋亡率;RT-PCR检测Bax/Bcl-2等凋亡相关基因mRNA水平改变;并通过RT-PCR筛选参与外源性信号通路的死亡受体配体对;Western blot检测凋亡相关基因caspase-8、caspase-9的蛋白表达和caspase-3剪切片段的表达;预先加入或不加入caspase抑制剂处理HL-60细胞,采用Annexin V/PI流式试剂盒检测两药联合后细胞凋亡的变化;Western blot检测ERK、Pi-ERK,P38、Pi-P38,JNK、Pi-JNK的蛋白表达;分别加入MAPK抑制剂后流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过WB检测caspase-3的蛋白表达;建立APL动物模型验证ORI+VPA能否诱导白血病细胞凋亡。结果冬凌草甲素与VPA联合治疗抑制HL-60细胞增殖;VPA增强冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡;光学显微镜下和Hoechst33342染色后荧光显微镜下观察:ORI+VPA组比单独用药组细胞凋亡率多;冬凌草甲素和VPA联合作用激活caspase-3、caspase-8和caspase-9;内源性凋亡途径中Bax蛋白表达增高,而Bcl-2蛋白表达降低;外源性凋亡途径中死亡受体配体对Fas/fasl表达增高;MAPK信号通路中ERK和P38发生磷酸化,而JNK未发生磷酸化;APL动物模型中ORI+VPA组实体瘤体积最小,TUNEL结果显示ORI和VPA能诱导白血病细胞凋亡。结论VPA确实能促进ORI诱导HL-60细胞凋亡,两者具有协同作用;VPA+ORI诱导HL-60细胞凋亡具有caspase依赖性;凋亡通过内源性和外源性两条途径,且死亡受体DR4/DR5和Fas/Fasl均参与介导外源性凋亡途径;ERK和P38两条非特异性信号通路参与诱导细胞凋亡;而JNK信号通路基本没有参与诱导细胞凋亡;建立APL动物模型,由体内试验进一步验证了体外实验结果,两者相符。
【关键词】：VPA 冬凌草甲素 凋亡 白血病 HL-60细胞 MAPK caspase
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 研究生导师及课题小组成员简介5-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 主要符号表13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-27
• 1.1 主要材料和仪器16-18
• 1.2 HL-60白血病细胞的传代与培养18
• 1.3 CCK-8 检测两药联合作用18-19
• 1.4 细胞形态学观察19
• 1.5 Annexin V/PI流式试剂盒检测细胞凋亡19-20
• 1.6 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析20-24
• 1.7 蛋白质免疫印迹(Western blot)分析24-26
• 1.8 白血病小鼠动物模型的建立26
• 1.9 统计学处理方法26-27
• 结果27-44
• 2.1 冬凌草甲素与VPA联合治疗抑制HL-60细胞增殖27-29
• 2.2 VPA增强冬凌草甲素诱导HL-60细胞凋亡29-32
• 2.3 冬凌草甲素和VPA联合作用激活caspase-3、caspase-8 和caspase-932-34
• 2.4 内源性凋亡通路中关键分子的表达34-36
• 2.5 外源性凋亡通路中关键分子的表达36-37
• 2.6 MAPK信号通路与ORI和VPA诱导HL-60细胞凋亡的关系37-41
• 2.7 APL动物模型验证冬凌草甲素和VPA联合作用机制41-43
• 2.8 凋亡信号通路相关模式图43-44
• 讨论44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-53
• 综述53-61
• 参考文献58-61
• 攻读硕士学位期间的研究成果61-62
• 致谢62

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本文编号：648263