人肝细胞癌中DEK基因的转录调控机制研究

发布时间：2017-08-11 00:06

  本文关键词：人肝细胞癌中DEK基因的转录调控机制研究

  更多相关文章： 肝细胞癌 DEK 启动子 AP-2α转录因子 转录调控

【摘要】：目的：DEK蛋白在多种人类侵袭性肿瘤中均出现过表达,目前已被确认为是一种癌基因,与恶性肿瘤的发生发展密切相关。前期研究结果显示,DEK基因在人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达量明显高于正常肝细胞,提示DEK可能在HCC的发病机制中发挥重要作用；同时,DEK基因核心启动子序列(-167bp～+35bp)的甲基化水平在HCC细胞系和正常肝细胞中存在显著差异,且在HCC细胞系中普遍处于低甲基化状态。鉴于目前对DEK基因的转录表达调控机制研究还比较少,因此本研究在前期工作基础上,进一步对DEK基因核心启动子序列进行分析和后续研究,以确定调控该基因转录表达的重要转录因子,从而揭示DEK基因在人肝细胞癌中过表达的转录调控机制。方法：基于前期的工作基础,本研究运用在线软件TFSEARCH 对 DEK启动子CpG岛区域可能结合的转录因子及其结合位点进行预测,结合DNA甲基化差异分析,初步筛选出对DEK基因核心启动子区转录活性起重要调控作用的转录因子及其结合位点。之后,对预测的转录因子结合位点进行定点突变和缺失突变来验证该转录因子结合位点是维持DEK基因启动子活性的重要调控区。最后,利用siRNA干扰、转录因子过表达实验和染色质免疫沉淀(ChIP)技术验证预测的重要转录因子对DEK基因启动子活性及其转录表达的调控作用以及与DEK启动子在HCC细胞系中的相互作用。结果：双荧光素酶报告基因结果显示,DEK截短启动子序列中紧邻转录起始位点的CpG2-2片段对DEK启动子活性影响最大。进一步,TFSEARCH预测结果发现,CpG2-2区域存在AP-2a等转录因子的特异结合位点,结合正常细胞与组织以及HCC细胞系中甲基化位点差异分析发现AP-2a结合位点的甲基化差异最大,因此我们预测AP-2a是调控DEK启动子转录活性的重要转录因子之一。之后,定点突变和缺失突变实验结果表明,AP-2a转录因子结合位点可明显调控DEK核心启动子的转录活性；进一步的siRNA干扰、转录因子过表达实验和染色质免疫沉淀(ChIP)结果显示,在HCC细胞系中转录因子AP-2a可与DEK启动子区相互作用,并正向调控DEK基因的转录表达。结论：综上实验结果我们得出结论,AP-2a是人肝细胞癌中DEK基因过表达的重要转录调控因子之一,通过与DEK核心启动子区CpG2-2中的转录因子结合位点相互作用,从而促进HCC细胞系中DEK基因的转录表达。
【关键词】：肝细胞癌 DEK 启动子 AP-2α转录因子 转录调控
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-19
• 1.1 肝细胞癌13
• 1.2 DEK蛋白13-14
• 1.3 启动子甲基化与基因的转录表达14-15
• 1.4 肝细胞癌中DEK基因相关研究15-16
• 1.5 研究意义16
• 1.6 研究目的和内容16-17
• 1.6.1 研究目的16
• 1.6.2 研究内容16-17
• 1.7 技术路线17-19
• 2 实验材料19-25
• 2.1 细胞培养相关实验材料及主要试剂19
• 2.1.1 细胞株19
• 2.1.2 细胞培养所用主要试剂19
• 2.2 细菌培养相关实验材料及主要试剂19
• 2.2.1 细菌菌株19
• 2.2.2 细菌培养所用主要试剂19
• 2.3 质粒载体、siRNA以及RT-PCR引物序列19-21
• 2.3.1 质粒载体19-20
• 2.3.2 siRNA以及RT-PCR引物序列20-21
• 2.4 主要试剂盒与相关试剂21-22
• 2.5 主要溶液的配制22-23
• 2.6 主要仪器设备23-25
• 3 实验方法25-39
• 3.1 HCC细胞系的复苏、培养与冻存25-26
• 3.1.1 HCC细胞系的复苏25
• 3.1.2 HCC细胞系的培养25
• 3.1.3 HCC细胞系的冻存25-26
• 3.2 HCC细胞系总RNA的提取以及RT-PCR检测mRNA表达水平26-28
• 3.2.1 HCC细胞系总RNA的提取26-27
• 3.2.2 RT-PCR检测mRNA表达水平27-28
• 3.3 Western blotting检测蛋白表达水平28-31
• 3.3.1 所用抗体的稀释比及蛋白分子量大小28-29
• 3.3.2 HCC细胞系总蛋白的提取29
• 3.3.3 SDS-PAGE凝胶的配制29-30
• 3.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳30
• 3.3.5 转膜(半干转)以及封闭30-31
• 3.3.6 一抗、二抗孵育31
• 3.3.7 ECL化学反应发光法显影曝光31
• 3.4 质粒的转化以及提取31-34
• 3.4.1 感受态细胞(E.coli DH5α)的制备31-32
• 3.4.2 质粒的转化以及挑单克隆32
• 3.4.3 质粒的提取32-33
• 3.4.4 转染级质粒的提取33-34
• 3.5 转染HCC细胞系34
• 3.6 AP-2α转录因子结合位点的定点突变与缺失突变34-35
• 3.7 染色质免疫沉淀(ChIP)35-37
• 3.8 荧光素酶活性分析37-38
• 3.9 生物信息学分析38
• 3.10 统计学分析38-39
• 4 实验结果39-47
• 4.1 HCC细胞系中DEK基因核心启动子序列中转录因子结合位点的预测分析39
• 4.2 AP-2α转录因子结合位点是维持DEK基因启动子活性的重要调控区39-41
• 4.3 转录因子AP-2α对HCC细胞系中DEK核心启动子转录活性的影响41-42
• 4.4 转录因子AP-2α对HCC细胞系中DEK基因表达水平的影响42-45
• 4.4.1 AP-2α siRNA干扰对HCC细胞系中DEK基因表达水平的影响42-44
• 4.4.2 AP-2α过表达对HCC细胞系中DEK基因表达水平的影响44-45
• 4.5 转录因子AP-2α与HCC细胞系中DEK启动子区的相互作用45-47
• 5 讨论47-49
• 6 结论49-50
• 参考文献50-54
• 附录A54-56
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果56-58
• 学位论文数据集58

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本文编号：653288