Galectin-3通过EGFR介导调控肿瘤细胞E-cadherin表达的机制研究

发布时间：2017-08-12 12:40

  本文关键词：Galectin-3通过EGFR介导调控肿瘤细胞E-cadherin表达的机制研究

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【摘要】：半乳糖凝集素(galectin)家族是哺乳动物p-半乳糖苷连接蛋白,与p-半乳糖苷有很强的亲和力,并且都含有一段保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain, CRD)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是galectin家族中唯一的嵌合型代表,含有1个CRD和12个氨基酸残基组成的N端结构域。Galectin-3蛋白含251个氨基酸残基,相对分子质量为31,000 Da,调节肿瘤细胞的凋亡、粘附、增殖和血管形成。Galectin-3具有各种各样的生物功能是因为其复杂的细胞亚结构分布,使它能与各种不同的配体结合产生生物效应。细胞粘附分子(cell adhesion molecules, CAMs),通过调节细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质之间的反应参与肿瘤细胞转移过程。基于序列同源性和结构不同,CAMs家族分成以下几类：钙粘蛋白(cadherin),选择素(selectin),整合素(integrin),免疫球蛋白超家族,淋巴细胞寻靶受体,如CD44。E-钙粘蛋白(E-cadherin)是经典钙粘蛋白中的原型成员,在保持上皮细胞极性和完整性方面发挥特别重要的作用。在细胞外,毗邻细胞的两个E-cadherin分子通过其细胞外部分含有钙离子的五个重复序列片段结合,形成黏着斑。在细胞内,E-cadherin通过α,β-,和p-120 catenin与细胞骨架连接。本论文研究galectin-3和E-cadherin这两个肿瘤因子的内在联系及其调节肿瘤发生的机制,而EGFR通路与galectin-3和E-cadherin都有紧密的联系,所以我们首先探讨了EGF诱导对二者联系的必要性。MTT实验显示,无论EGF的刺激与否,galectin-3抑制剂β-Lactose都能抑制肿瘤细胞A549的增殖,所以,EGF刺激对于galectin-3的抗凋亡是无关紧要的。但划痕实验显示,EGF可以诱导A549的迁移,western blotting实验结果也显示只有在EGF存在时,galectin-3对E-cadherin的表达才有影响,我们研究的E-cadherin主要参与肿瘤的侵袭转移,所以我们选择EGF诱导进行后续实验。采用western blotting摸索EGF诱导EGFR磷酸化的时间相关性,结果显示,在15min时,p-EGFR表达最高,为使实验结果更明显,后续都采用EGF诱导15min进行实验。Western blotting结果显示在EGF诱导下,在高表达galectin-3的人乳腺癌细胞MCF-7和人结肠癌细胞HCT-116中,β-Lactose下调E-cadherin和β-catenin的表达,而在低表达galectin-3的A549细胞中,β-Lactose对E-cadherin和β-catenin的表达无影响。结果表明,细胞表面的galectin-3上调肿瘤细胞内E-cadherin和β-catenin的表达。Western blotting结果显示在EGF诱导下,外源性的人重组galectin-3下调A549中E-cadherin的表达,上调β-catenin的表达。为了进一步证明galectin-3调节β-catenin的具体机制,分别提取A549细胞中胞浆和胞核蛋白后进行western blotting实验,结果显示galectin-3可促使β-catenin进入细胞核。另外,免疫共沉淀实验显示,外源性galectin-3对E-cadherin/ β-catenin复合体没有显著影响。这些结果表明,外源性galectin-3下调肿瘤细胞内E-cadherin的表达,上调β-catenin的表达,促进β-catenin入核,但不影响E-cadherin/β-catenin复合体。综上所述,galectin-3和E-cadherin这两个肿瘤因子有着重要的内在联系,并且细胞不同亚结构分布的galectin-3对E-cadherin的调控作用不同。
【关键词】：半乳糖凝集素-3 E-钙粘蛋白 β-连环蛋白 表皮生长因子受体
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 符号说明12-14
• 前言14-27
• 1. Galectin-3简介14-16
• 2. Galectin-3的生物学功能16-19
• 3. 以Galectin-3为靶点的抑制剂研究19-21
• 4. Galectin-3肿瘤临床诊断和预后的应用21
• 5. E-cadherin21-24
• 6. E-cadherin的功能24-25
• 7. EGFR25-26
• 8. 本课题研究的主要方向26-27
• 实验部分27-46
• 1. 实验材料27-29
• 1.1 化合物27
• 1.2 细胞株及其培养27
• 1.3 试剂27-28
• 1.4 试剂配制28-29
• 1.5 仪器设备29
• 2. 实验方法29-34
• 2.1 肿瘤细胞生长抑制试验29-30
• 2.2 Western blotting法检测相关蛋白表达实验30-33
• 2.3 划痕实验33
• 2.4 亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取实验33-34
• 2.5 免疫共沉淀实验34
• 2.6 统计学方法34
• 3. 实验结果34-42
• 3.1 EGF诱导A549细胞的迁移34-35
• 3.2 EGF诱导EGFR的磷酸化活化35
• 3.3 β-Lactose抑制肿瘤细胞生长35-37
• 3.4 β-Lactose诱导E-cadherin和β-catenin下调37-40
• 3.5 细胞外galectin-3诱导E-cadherin下调和β-catenin上调40-41
• 3.6 细胞外galectin-3诱导β-catenin从细胞质进入细胞核41
• 3.7 细胞外galectin-3对E-cadherin/β-catenin复合体的作用41-42
• 4. 讨论42-45
• 5. 结论45-46
• 参考文献46-58
• 致谢58-59
• 硕士学位期间发表或待发表的论文59-60
• 附件60

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本文编号：661680