cRGD通过下调uPA蛋白及逆转EMT抑制卵巢癌血管生成拟态形成

发布时间：2017-08-12 22:15

  本文关键词：cRGD通过下调uPA蛋白及逆转EMT抑制卵巢癌血管生成拟态形成

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【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一,死亡率居妇科肿瘤首位。众所周知,由血管提供的充分氧气及营养物质是肿瘤生长,发展及转移的必需物质。Jain等研究团队提出的“肿瘤饥饿疗法”是指通过抑制肿瘤新生血管的生成从而抑制肿瘤的生长。然而,肿瘤血管均由血管内皮细胞构成这一认知遭到血管生成拟态的挑战。血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是一种存在于高度恶性肿瘤组织中的供血途径,如卵巢癌、乳腺癌和肝癌等。这种不寻常的供血管道是由具有可塑性的恶性肿瘤细胞通过自身变形在没有内皮细胞的参与下,与细胞外基质共同构成的。越来越多的研究表明血管生成拟态与卵巢癌的分期,转移及患者5年生成率相关。因此,深入的研究血管生成拟态形成的分子机制,并在此机制上寻找理想的卵巢癌血管生成拟态抑制剂从而来改善卵巢癌治疗结局是非常重要的。研究证实参与形成血管生成拟态的肿瘤细胞展现出了内皮细胞的特征,这类似于上皮间质转化过程。上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)是一种动态的生物学过程,其主要的特征是肿瘤细胞上皮细胞表型转化为间充质细胞表型,同时细胞形态发生相应的变化,通过EMT,肿瘤细胞获得了较高的迁移能力。更重要的是,文献已报道发生EMT化的肿瘤细胞更容易形成血管生成拟态。而且,某些EMT过程中的调节因子也已经被证实涉及到VM形成中。但是,EMT化的肿瘤细胞在形成血管生成拟态前必须对其细胞外基质进行溶解。uPA蛋白是一种多功能的丝氨酸,由卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞分泌,它可正向调节肿瘤细胞的增殖,提高细胞的粘附性。由于高水平的uPA蛋白预示着肿瘤的不良预后,美国肿瘤临床协会呼吁临床医生将其作为肿瘤预后的评估因子。uPA蛋白通过溶解细胞外基质及基底膜,允许细胞穿过屏障,在肿瘤转移及肿瘤血管生成中扮演着重要的角色。然而,到目前为止,uPA蛋白是否能通过它对细胞外基质的溶解作用参与血管生成拟态的形成,进而成为一个血管生成拟态的治疗靶点尚不清楚。肿瘤新生血管的内皮细胞上高表达整合素舛β3。研究表明,外源性的RGD肽能特异性的结合整合素叫β3,从而抑制由内皮细胞构成的肿瘤血管。环状的RGD肽(cRGD)由于多价态可以同时和几个叫β3相结合,因此较线形RGD多肽有更高的受体结合特异性,展现出更强的抑制肿瘤传统血管的能力。然而,并没有文献报道外源性cRGD肽对于血管生成拟态的影响。在乳腺癌中,RGD肽可通过与叫β3相结合下调uPA蛋白的表达,而且,RGD肽与整合素avβ3结合后通过加强细胞与细胞/细胞外间质的连接抑制细胞的迁移、侵袭和EMT化。因此,这激发我们的兴趣去探讨外源性cRGD肽是否能够通过下调uPA的表达和逆转EMT抑制卵巢癌血管生成拟态形成。为了进一步的探究uPA蛋白对于卵巢癌血管生成拟态形成的作用,我们首先在细胞水平及卵巢癌组织水平探讨uPA蛋白与血管生成拟态的关系,并试图去揭示其潜在的分子机制,作为治疗靶点的潜能性。更重要的是,我们拟从基因水平、蛋白水平及细胞生物学特性的角度验证外源性cRGD肽是否可以通过下调uPA的表达和逆转EMT抑制血管生成拟态。第一章uPA对卵巢癌血管生成拟态形成的影响目的旨在从组织水平及细胞水平深入探究uPA蛋白对卵巢癌血管生成拟态形成的作用及其可能的分子机制,这对丰富完善肿瘤血管生成拟态理论有重要的意义,同时为临床上卵巢癌抗血管生成治疗提供靶点。方法1.卵巢癌组织水平上探究uPA蛋白与卵巢癌血管生成拟态的关系首先对前期试验中收集来自广州珠江医院病理科的90例经手术切除的卵巢癌组织进行uPA蛋白免疫组织化学染色及CD34-PAS双重染色。统计分析uPA蛋白表达、血管生成拟态结构与临床数据的关系及uPA蛋白表达与血管生成拟态结构的关系。2.体外三维培养比较不同卵巢癌细胞形成血管生成拟态的能力150此基质胶加入24孔细胞培养板中,在37℃孵箱中静置45 min,收集生长处于对数期的SKOV-3、OVCAR-3、A2780和HUVEC细胞以3.5×105个/孔的细胞密度加入到基质胶表面放入37℃细胞孵箱中孵育8 h,倒置显微镜观察VM管腔结构形成情况。3. Western Blot检测各种卵巢癌细胞uPA蛋白表达水平分别提取SKOV-3、OVCAR-3和A2780卵巢癌细胞的蛋白样品,用BCA法进行蛋白定量。计算50嵋蛋白的溶液体积即为上样量,SDS-PAGE电泳,转到PVDF膜上,5% BSA溶液进行封闭,孵育uPA一抗4℃过夜,次日洗膜,孵育二抗后进行曝光。选用GAPDH作为内源性对照。4.细胞瞬时转染及RT-PCR和Western Blot检测转染后uPA表达水平待铺至6孔板中的SKOV-3和OVCAR-3细胞融合至70%-80%,取uPA干扰片段(si-RNA)及其阴性对照组片段(si-NC)各100 pmoL分别与脂质体lipofectamin 2000 5μL混合,并按照按lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明书进行转染。分别提取被转染48/72 h的SKOV-3和OVCAR-3细胞si-RNA和si-NC组中的RNA和蛋白运用RT-PCR和Western Blot检测uPA RNA和蛋白的表达情况。5.体外三维培养检测下调uPA蛋白表达对卵巢癌细胞血管生成拟态形成能力的影响用已被成功下调uPA蛋白表达的SKOV-3和OVCAR-3细胞si-RNA和si-NC组细胞进行体外三维培养,比较干扰uPA蛋白表达前后两种卵巢癌细胞形成血管生成拟态能力的变化。6. Western Blot检测下调uPA蛋白表达对卵巢癌血管生成拟态相关基因表达的影响分别提取已被成功下调uPA蛋白表达的SKOV-3和OVCAR-3细胞si-RNA和si-NC组细胞的蛋白,Western Blot检测uPA、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、MMP-2和Laminin5y2蛋白的表达情况。选用GAPDH作为内源性对照。结果1.VM结构、uPA蛋白表达与临床资料的关系免疫组化发现90例卵巢癌组织标本中uPA蛋白表达水平不同。根据免疫组化中阳性细胞率联合染色强度的评分法则将卵巢癌组织分成uPA(-/+)、uPA(++)和uPA(+++)三组。将uPA(-)和uPA(+)定义为低表达,将uPA(++)和uPA(+++)定义为高表达。我们发现在早期和晚期卵巢癌组织中uPA蛋白高表达率分别为36%和82.5%,差异有统计学意义(P=0.000)。在低分化、中分化、高分化的卵巢癌中uPA蛋白高表达率分别为77.3%、41.6%和59.4%,差异有统计学意义(P=0.028)。CD34-PAS双染结果发现,某些组织中出现VM结构(表现为PAS阳性,CD34阴性的管腔结构,这些管腔结构由肿瘤细胞和细胞外基质构成,其内偶见红细胞)阳性率为40% (36/90)。在早期和晚期卵巢癌组织中VM阳性率分别为26%和57.5%,差异有统计学意(P=0.003)。在低分化、中分化、高分化的卵巢癌中uPA蛋白高水平表达率分别为64%、53%和14%,差异有统计学意义(P=0.000)2.uPA蛋白与VM在卵巢癌组织中的关系从uPA在VM阳性卵巢癌组织中表达情况和VM在uPA蛋白不同的组织中阳性率两方面进一步分析卵巢癌组织中uPA蛋白表达与VM的关系。我们发现VM在uPA(-/+)、uPA(++)和uPA(卅)三组中出现的阳性率分别为18.1%、41.7%和57.1%。uPA蛋白在VM阳性组中高表达：22.2%uPA(-/+)、30.5 %uPA(++)和47.3%uPA(+++),而在VM阴性中仅有20.3%uPA(+++)。3.uPA蛋白与VM在卵巢癌细胞中的关系体外三维培养检测卵巢癌细胞形成VM的能力,并且用HUVEC细胞作为阳性参照组。结果显示：卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞可自发首尾相接形成大量的血管腔样网状结构即VM现象,这种管腔样结构与HUVEC细胞形成管腔结构相似,且SKOV-3形成这种结构的能力强于OVCAR-3 (P0.05),而A2780细胞则不能形成VM结构。Western Blot结果表明,各种卵巢癌细胞中,形成VM能力最强的SKOV-3细胞的uPA蛋白表达水平最高,不能形成VM结构的A2780细胞的表达水平最低,而OVCAR-3细胞的表达水平则居中。4.下调uPA蛋白对卵巢癌细胞形成VM的影响用uPA的干扰片段(si-RNA组)和对照组片段(si-NC组)瞬时转染卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞,RT-PCR and Western blot结果显示我们成功下调它们uPA蛋白表达水平。体外三维培养结果显示在SKOV-3和OVCAR-3细胞中,si-RNA和si-NC组中卵巢癌细胞形成VM能力之间的差异有统计学意义(SKOV-3细胞中P0.001,OVCAR-3细胞P0.01)。对于这两株细胞,下调uPA蛋白表达后,其形成VM的能力下降。5.uPA蛋白促进VM形成的相关机制与si-NC组相比,si-RNA组中卵巢癌SKOV-3中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR及MMP-2的表达量明显减少,而能将细胞固定在基膜上Laminin5γ2被分解得少；OVCAR-3细胞中AKT.mTOR的量未见明显改变,但是它们的活化形式p-AKT与p-mTOR,以及MMP-2的表达量明显减少,而能将细胞固定在基膜上Laminin5γ2被分解得少。结论1.uPA蛋白表达/VM阳性率和卵巢癌组织分期、分级相关：分期越晚/低分化,uPA蛋白表达水平越高/VM阳性率越高；2.uPA蛋白促进了卵巢癌细胞VM形成；3.uPA蛋白通过AKT/mTOR/MMP-2/Laminin5γ2信号通路促进卵巢癌VM的形成,可成为卵巢癌VM治疗靶点。第二章cRGD对卵巢癌血管生成拟态的作用及其机制第一节cRGD通过下调uPA抑制卵巢癌血管生成拟态形成目的研究表明内源性RGD下调乳腺癌中uPA蛋白表达水平,而我们上一章中显示uPA蛋白是一个治疗卵巢癌VM的有效靶点。本节研究旨在研究外源性的环状RGD(cRGD)是否可下调卵巢癌中的uPA蛋白,从而抑制卵巢癌VM形成。方法1.MTT实验筛选cRGD适合的实验剂量5×103/孔的SKOV-3和OVCAR-3进行96孔板铺板孵育24 h。不同浓度的cRGD药物及其相应的对照组溶液按实验设计加入SKOV-3和OVCAR-3细胞中作用48 h。加入20μL MTT试剂(5 mg/mL)继续孵育后每孔再加入150 μLDMSO溶液,避光,轻震,利用酶标仪(选择540 nm波长)测定各孔吸光值。每次设置3个重复孔,实验重复3次。2.体外三维培养验证cRGD对卵巢癌细胞形成VM能力的影响用无血清RPMI-1640将SKOV-3和OVCAR-3制成细胞悬液,3.5×105个/孔细胞加入到基质胶表面,用PBS溶解cRGD,以40 nM浓度加入每孔(cRGD),对照组(Control)中加入相同体积的PBS溶液,显微镜下观察各细胞形成VM的能力。3. Western Blot检测cRGD作用后uPA促进卵巢癌细胞形成VM信号通路蛋白的变化分别提取cRGD作用48 h后的SKOV-3和OVCAR-3细胞和它们的Control组细胞的蛋白,Western Blot检测uPA、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、MMP-2和Laminin5y2蛋白的表达情况。选用GAPDH作为内源性对照。结果1.40 nM cRGD作为后续实验cRGD的使用剂量MTT结果显示：cRGD对于SKOV-3的IC50值为6160 nM, cRGD对于OVCAR-3的IC50值为536 nM。本研究中选用的cRGD浓度(40 nnM)均远小于它们的IC50,排除后续实验结果因cRGD对卵巢癌细胞的毒性所致。2. cRGD对卵巢癌细胞VM形成的影响体外三维培养结果显示：cRGD作用48 h后,与它们各自的Control组相比,卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞形成VM的能力明显下降,两种细胞的cRGD与Control组之间差异有统计学意义(均P0.001)3. cRGD对uPA蛋白促进卵巢癌细胞形成VM信号通路蛋白的影响用Western blot检验cRGD治疗48 h后的SKOV-3和OVCAR-3细胞株中AKT/mTOR/MMP-2/Laminin5y2信号通路蛋白的变化。与Control组相比,cRGD组中卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞的uPA下调,其下游的AKT、p-AKT、 mTOR、p-mTOR、MMP-2表达水平明显降低,而能将细胞固定在基膜上Laminin5y2被分解得少。结论1. cRGD通过下调uPA,从而调节AKT/mTOR/MMP-2/Laminin5y2信号通路抑制卵巢癌VM的形成。2.再次验证uPA蛋白促进卵巢癌VM形成的信号通路。第二节cRGD逆转EMT抑制卵巢癌血管生成拟态形成目的上皮间充质转化(EMT)是促进恶性肿瘤VM形成的重要因素之一。本节研究旨在研究cRGD是否可通过逆转肿瘤细胞的EMT,从而抑制卵巢癌VM形成。方法1. Transwell检测cRGD对卵巢癌细胞迁移能力的影响对数生长期的卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞,1×104/室细胞铺在上室,下室中加入含10%FBS RPMI-1640细胞培养液。40 nM cRGD作用10 h后,收小室制片,倒置显微镜下随机选取不重叠的五个视野拍照并统计处理数据。2. Border检测cRGD对卵巢癌细胞侵袭能力的影响将transwel小室铺基质胶,1×104/室SKOV-3和OVCAR-3细胞铺在上室,下室中加入含10%FBS RPMI-1640细胞培养液。40 nM cRGD作用12h后,收小室制片,倒置显微镜下随机选取不重叠的五个视野拍照并统计处理数据。3.免疫荧光检测cRGD对卵巢癌细胞EMT相关蛋白的影响将SKOV-3和OVCAR-3细胞进行爬片,以40 nM cRGD作用于卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞48 h后,孵育一抗、二抗后,用Hochest33342染核,激光共聚焦定性观察细胞三种蛋白表达情况。4. Western Blot检测cRGD作用或下调uPA后对卵巢癌细胞EMT相关蛋白的影响cRGD作用卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞48 h后或是成功干扰uPA表达后,提取它们和各自对照组中蛋白,Western Blot检测细胞E-cadherin, N-cadherin和Vimentin表达。选用GAPDH作为内源性对照。5.观察cRGD及下调uPA对卵巢癌细胞形态的影响cRGD作用卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞48 h后或是成功干扰uPA表达后,倒置显微镜下观察处理组和对照组中细胞形态的变化。结果1. cRGD对卵巢癌细胞侵袭迁移能力的影响Transwell及Border实验结果显示：和Control组相比,cRGD作用48 h后的卵巢癌细胞迁移及侵袭能力明显下降(P值均0.001)。2. cRGD对卵巢癌细胞EMT相关蛋白的影响免疫荧光及Western Blot结果显示：和Control组相比,cRGD上调卵巢癌细胞E-cadherin表达,下调卵巢癌细胞N-cadherin和Vimentin表达。下调SKOV-3细胞uPA后,与si-NC组相比,这三种蛋白无变化；下调OVCAR-3细胞uPA后,E-cadherin表达无变化,N-cadherin表达减少,而Vimentin表达增多。3. cRGD对卵巢癌细胞形态的影响cRGD作用SKOV-3和OVCAR-3细胞48 h后,与Control组相比,cRGD使细胞触角变少,细胞变圆,细胞之间连接变紧密。下调SKOV-3细胞uPA后,与si-NC组相比,si-RNA组卵巢癌细胞形态无明显改变。结论1. cRGD可通过逆转EMT抑制卵巢癌VM形成。2. cRGD逆转EMT的作用并不是由于它下调卵巢癌细胞uPA蛋白的表达。
【关键词】：卵巢癌 血管生成拟态 尿激酶型纤溶酶原激活物 上皮间质转化 外源性环状RGD
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-31
• 参考文献29-31
• 第一章 uPA对卵巢癌血管生成拟态形成的影响31-57
• 一、引言31
• 二、实验材料与方法31-44
• 三、结果44-51
• 四. 讨论51-54
• 五、结论54
• 参考文献54-57
• 第二章 cRGD对卵巢癌血管生成拟态的作用及其机制57-83
• 第一节 cRGD通过下调uPA抑制卵巢癌血管生成拟态形成57-66
• 一、引言57
• 二、实验材料与方法57-63
• 三、实验结果63-66
• 第二节 cRGD通过逆转EMT抑制卵巢癌血管生成拟态形成66-81
• 一、引言66
• 二、实验材料与方法66-73
• 三、实验结果73-78
• 四、讨论78-80
• 五、结论80-81
• 参考文献81-83
• 全文总结83-84
• 缩略语84-85
• 抗体信息85-86
• 学位攻读期间科研成果86-87
• 致谢87-88

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