探究肿瘤相关基因GIPC2的表达调控机制

发布时间：2017-08-13 01:17

  本文关键词：探究肿瘤相关基因GIPC2的表达调控机制

  更多相关文章： GIPC2 基因表达调控 同源序列 核心启动子 顺式作用元件

【摘要】：研究背景：目前在结直肠癌和恶性黑色素瘤中发现了GIPC2的外显子突变,在胃癌中发现了GIPC2表达上调,相反在肾癌、血癌和肾上腺皮质瘤GIPC2表达下调；31例白血病中发现29例GIPC2的启动子区高甲基化。这些结果都提示GIPC2可能与肿瘤的发生发展相关。研究材料和方法：本研究主要通过构建人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游2000bp序列的一系列不同长度截短片段插入至Basic-pGL3多克隆位点的重组质粒,转染到HEK293、HEK293T和PC12等细胞中检测不同长度截短片段所表现出来的转录活性。包括利用1)Vista比对不同物种GIPC2基因编码区和非编码区序列,得到GIPC2同源序列；2)分别构建插入人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游不同长度截短片段的重组质粒,转染人HEK293T细胞和大鼠PC12细胞；3)根据报告基因荧光强度推断人和大鼠GIPC2的核心启动子区；4)将人GIPC2内含子区同源序列置于核心启动子前面,构建重组质粒,转染HEK293T,HT-29和PC12细胞,检测转录活性；5)将人Human-40与Human-30之间保守碱基突变和大鼠Rat-S8与Rat-S11之间最保守碱基单核苷酸突变和次保守碱基突变,构建成重组质粒转染HEK293T口PC12细胞；6)将大鼠Rat-S8、Rat-S11和Rat-S14转染αt-KG处理HEK293T和PC12细胞,检测a-KG对GIPC2的调控作用；7)提取5'aza处理的HEK293T口PC12细胞mRNA, Q-PCR检测5'aza对GIPC2的调控作用。8)体外甲基化人和大鼠l3IPC2第一个外显子,放在核心启动子前面,构建成重组质粒转染PC12细胞,检测甲基化对GIPC2第一个外显子的调控作用。研究结果：生物信息学分析发现GIPC2在各个物种中非常保守,哺乳动物氨基酸序列和编码区序列同源性大于80%；确定了人和大鼠GIPC2核心启动子为+32至+190序列区域；人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2启动子活性的功能；人和大鼠GIPC2第一个内含子内的同源序列有促进启动子活性的功能；人和大鼠GIPC2第一个外显子具有促进GIPC2启动子活性的功能,但是甲基化后促进启动子活性的功能消失；α-KG可作用于Rat-S8与Rat-S11之间的序列,使得这段序列的抑制启动子功能消失；5'aza处理HEK293T和PC12细胞后,发现GIPC2表达量升高100多倍。研究结论：本研究确定了GIPC2的核心启动子区域。在非编码区域找到了一系列潜在的顺式作用元件能够调控GIPC2的表达。发现GIPC2第一个外显子具有调控GIPC2表达的功能。
【关键词】：GIPC2 基因表达调控 同源序列 核心启动子 顺式作用元件
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 一 引言6-18
• 1.1 GIPC2基因6-7
• 1.2 基因表达调控方式7-15
• 1.2.1 转录水平调控8-12
• 1.2.2 转录后水平调控12-15
• 1.2.3 表观水平调控15
• 1.3 双荧光报告系统研究基因表达调控15-18
• 二 材料和方法18-28
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 细胞18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 主要试剂盒18
• 2.1.4 主要耗材,仪器及设备18-20
• 2.1.5 溶液配制20
• 2.2 实验方法20-28
• 2.2.1 细胞培养、传代、复苏及冻存20-21
• 2.2.2 基因组DNA提取,RNA提取21-22
• 2.2.3 快速琼脂糖凝胶DNA回收22-23
• 2.2.4 质粒中量提取23-24
• 2.2.5 RIPA法裂解细胞提取总蛋白和BCA法测定蛋白浓度24
• 2.2.6 Westhern Bolt24-25
• 2.2.7 人和大鼠GIPC2基因翻译起始位点上游不同长度截短片段重组质粒构建和人和大鼠外显子、内含子高度同源序列重组质粒构建25-26
• 2.2.8 细胞转染和双荧光检测26
• 2.2.9 Vista及NCBI比对序列同源性和MethPrimer预测序列CpG island26-27
• 2.2.10 异丙醇/乙酸钠纯化DNA27
• 2.2.11 体外构建目标序列甲基化重组质粒27-28
• 2.2.12 逆转录及实时定量PCR检测基因表达28
• 三 实验结果28-44
• 3.1 GIPC2的保守性28-29
• 3.2 人和大鼠G/PC2核心启动子29-31
• 3.3 GIPC2的非编码区对GIPC2的调控作用31-38
• 3.4 α-KG对GIPC2的调控作用38-40
• 3.5 5'aza对GIPC2的调控作用40
• 3.6 GIPC2的编码区对GIPC2的调控作用40-44
• 四 讨论44-48
• 总结48-49
• 参考文献49-56
• 附录56-59
• 英文名词及缩写59-60
• 致谢60-61
• 个人简历61-62

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本文编号：664646