长链非编码RNA-RMRP影响胃癌发生的机制及其临床诊断价值研究

发布时间：2017-08-13 04:19

  本文关键词：长链非编码RNA-RMRP影响胃癌发生的机制及其临床诊断价值研究

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【摘要】：目的胃癌(gastric cancer,GC)是世界第4大常见恶性肿瘤,居全球癌症相关死因第2位,其5年总体生存率约25%。由于缺乏理想的早期胃癌诊断标志物,80%患者被诊断时已处于疾病进展期,多数胃癌患者的预后受到了极大限制。同时,由于胃癌病理生理机制的不清又进一步影响其临床治疗效果。因此,揭示胃癌的分子特征、更好地理解胃癌发病机制是当前胃癌研究的重点所在。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸(nuclotide,nt),具备多种生物学功能,涉及生理到病生一系列过程的非编码RNA分子。它们可在表观遗传、转录以及转录后等多个水平广泛参与基因表达的调控,影响肿瘤的发生和发展,与肿瘤侵袭、转移及患者预后密切相关。然而,lncRNA与胃癌的关系目前仍所知甚少。所以发现并鉴定胃癌相关lncRNA分子对于胃癌诊治将有重要意义。因此,本研究的首要目的是探索lncRNA参与胃癌发生的分子机制,同时明确lncRNA作为肿瘤标志物用于胃癌筛查和患者预后评估的临床价值。方法1.在lncRNA芯片筛选胃癌组织和配对癌旁组织中差异表达lncRNA的基础上,采用荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测lncRNA线粒体RNA处理核糖核酸内切酶RNA组份(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease,RMRP)在胃癌组织及其配对癌旁组织、正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)和5株胃癌细胞株(AGS,BGC-823,HGC-27,MGC-803和SGC-7901)中的表达水平差异。2.qrt-pcr分析rmrp在健康人胃黏膜组织、良性病变胃黏膜(溃疡和胃炎)、异型增生胃黏膜和各期胃癌组织中的表达规律。3.克隆测序技术证明血浆、胃液rmrp和gapdhmrna的存在性,反复冻融试验和不同时间和温度放置试验确定体液rmrp的稳定性,细胞上清试验探究体液rmrp来源。4.建立血浆和胃液lncrna检测方法,分析血浆和胃液rmrp在胃癌发生各阶段的变化规律;分析胃癌组织、血浆和胃液rmrp水平与患者临床病理因素之间的关系;构建受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线,确定血浆、胃液rmrp诊断价值。5.mircode软件预测与rmrp相互作用的mirna分子。6.设计并合成针对rmrp的小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)和rmrp的pcdna3.1表达载体,转染正常胃黏膜上皮细胞株和胃癌细胞株,qrt-pcr检测rmrp和细胞周期蛋白d2(cyclind2)的水平变化;沉默或上调细胞rmrp表达水平后,分别采用流式细胞仪(flowcytometer)、实时细胞分析仪(real-timecellanalyzer,rtca)和平板克隆形成试验(platecolonyformationassay)检测细胞周期、凋亡和增殖的变化。7.建立裸鼠胃癌移植瘤模型,体内实验验证rmrp的生物功能,分析血浆rmrp水平变化规律。结果1.与癌旁组织相比,rmrp在68.2%(90/132)胃癌组织中表达水平显著降低;相对于正常胃黏膜上皮细胞株(ges-1),5株胃癌细胞株(ags,bgc-823,hgc-27,mgc-803和sgc-7901)中的rmrp表达水平显著改变。2.qrt-pcr结果显示,rmrp表达水平只在胃癌前病变组织(异型增生)和胃癌组织中显著降低,在胃良性病变(胃溃疡和胃炎)组织中没有明显改变,显示出良好的胃癌相关性。3.克隆测序技术证明血浆、胃液中存在rmrp。血浆和胃液gapdhmrna水平恒定,是采用qrt-pcr方法检测体液lncrna水平的理想参照。4.冻融试验和不同时间、温度放置试验结果显示血浆和胃液rmrp水平基本不变,体液rmrp的稳定性可满足临床常规分析要求。细胞上清试验显示体液rmrp来源于细胞主动分泌。5.相对健康人群,血浆RMRP水平在胃癌患者群体中显著升高,胃癌术后随着肿瘤组织的切除明显回落;胃癌患者组的胃液RMRP水平显著升高。血浆和胃液RMRP作为胃癌筛查标志物具有较高的敏感性和特异性,优于传统肿瘤标志物。联合检测胃液RMRP、胃液CEA和血清CEA更可提高胃癌检出率。6.胃癌组织RMRP的表达水平与Borrmann分型(P=0.002)、侵袭程度(P=0.037)、淋巴结转移(P=0.014)、周围神经侵袭(P=0.008)以及组织CEA(P0.001)和CA19-9(P=0.003)表达情况密切相关。胃癌患者术前血浆RMRP水平与胃癌直径大小(P=0.031)、胃癌分期(P=0.038)、侵袭程度(P=0.017)和组织CEA表达情况(P=0.032)正相关,而术后2 w血浆RMRP回落程度与淋巴结转移(P=0.040)和组织CEA表达情况(P=0.049)密切相关。7.细胞实验和动物实验证明沉默RMRP表达能显著抑制肿瘤增殖,而上调RMRP表达则能促进细胞增殖和肿瘤生长。8.沉默细胞RMRP表达能使细胞周期显著阻滞于G0/G1期;相反,上调细胞RMRP表达水平后,能促进细胞周期从G0/G1期过渡到S期。进一步研究发现,RMRP可充当miR-206海绵,通过调控下游靶基因Cyclin D2表达发挥其细胞周期调控效应。结论经体内和体外机制研究,从正反两方面证明RMRP在胃癌的发生和发展中发挥着重要作用。大样本临床标本分析显示,RMRP是胃癌筛查和患者预后评估的潜在标志物。
【关键词】：胃癌 长链非编码RNA RMRP 肿瘤标志物 分子机制
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 引言16-19
• 1 研究内容和技术路线19-22
• 1.1 研究内容19-21
• 1.1.1 建立多种样本lnc RNA提取与定量分析方法19
• 1.1.2 组织RMRP表达水平检测19
• 1.1.3 血浆RMRP水平检测19
• 1.1.4 胃液RMRP水平检测19-20
• 1.1.5 系统分析体液中RMRP来源，明确体液RMRP生物学特性20
• 1.1.6 细胞转染与转染效率20
• 1.1.7 沉默和上调RMRP水平对胃癌细胞生长的影响20
• 1.1.8 建立裸鼠移植瘤动物模型，体内验证RMRP对胃癌细胞生长的影响20
• 1.1.9 分析RMRP影响细胞周期的分子机制20
• 1.1.10 其它lnc RNA与胃癌关系的研究20-21
• 1.2 技术路线21-22
• 2 材料与方法22-35
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 主要仪器22-23
• 2.1.2 主要试剂23-24
• 2.1.3 实验标本24
• 2.1.4 细胞株24
• 2.1.5 实验动物24
• 2.1.6 伦理批准及受试者知情权24
• 2.2 方法24-35
• 2.2.1 样本的采集与保存24-25
• 2.2.2 样本总RNA提取25-26
• 2.2.3 总RNA的定量与完整性检测26
• 2.2.4 q RT-PCR检测26-29
• 2.2.5 细胞培养29-30
• 2.2.6 pc DNA3.1-RMRP表达质粒的构建与扩增30-32
• 2.2.7 RMRP靶向si RNA设计与化学合成32
• 2.2.8 RTCA检测细胞增殖32
• 2.2.9 流式细胞术32-33
• 2.2.10 细胞平板克隆形成试验33
• 2.2.11 动物实验33-34
• 2.2.12 血浆RMRP来源与稳定性实验34
• 2.2.13 统计分析34-35
• 3 实验结果35-74
• 3.1 多种样本RNA提取与定量分析方法的建立35-39
• 3.1.1 利用Trizol提取组织总RNA，改良Trizol LS法提取血浆、胃液总RNA35-36
• 3.1.2 非变性 1 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性36
• 3.1.3 实时荧光q RT-PCR测定样本RMRP36-37
• 3.1.4 q RT-PCR产物进行克隆后测序证实样本RMRP存在性37
• 3.1.5 确认血浆和胃液GAPDH水平恒定，是RT-PCR检测lnc RNA的理想参照物37-39
• 3.2 q RT-PCR技术检测组织RMRP表达水平39-44
• 3.2.1 分析胃癌组织和配对癌旁组织RMRP表达水平的差异39-40
• 3.2.2 分析胃癌组织RMRP表达水平与患者临床病理因素之间的潜在关系40-42
• 3.2.3 分析胃黏膜异型增生组织和配对正常组织RMRP表达水平的差异42-43
• 3.2.4 横向比较正常胃黏膜组织、良性病变（胃溃疡、胃炎）、癌前病变（异型增生）、胃癌组织中RMRP表达情况43-44
• 3.3 q RT-PCR技术检测血浆RMRP水平44-50
• 3.3.1 分析胃癌患者术前、术后2周血浆RMRP水平差异44
• 3.3.2 分析胃癌患者术前血浆RMRP水平与临床病理因素之间的潜在关系44-46
• 3.3.3 分析胃癌患者术后血浆RMRP变化程度与临床病理因素之间的潜在关系46-48
• 3.3.4 横向比较健康人、胃癌术前患者、胃癌术后2周患者血浆RMRP水平48
• 3.3.5 构建ROC曲线确定血浆RMRP作为胃癌筛查标志物的灵敏度与特异度48-50
• 3.4 q RT-PCR技术检测胃液RMRP水平50-54
• 3.4.1 分析正常或轻度胃炎、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平差异50
• 3.4.2 分析胃癌患者胃液RMRP水平与临床病理因素之间的潜在关系50-52
• 3.4.3 构建ROC曲线确定胃液RMRP作为胃癌筛查标志物的灵敏度与特异度52-53
• 3.4.4 比较胃液RMRP、CEA和血清CEA在早期胃癌和进展期胃癌中的阳性检出率53-54
• 3.5 系统分析体液RMRP来源，明确体液RMRP生物学特性54-56
• 3.5.1 细胞上清试验初步探究RMRP的来源54-55
• 3.5.2 血浆反复冻融试验探究体液RMRP稳定性55
• 3.5.3 血浆不同放置时间和温度试验探究体液RMRP稳定性55-56
• 3.5.4 构建裸鼠胃癌移植瘤动物模型，验证血浆RMRP水平变化56
• 3.6 细胞转染与转染效率56-61
• 3.6.1 构建pc DNA3.1-RMRP表达质粒，合成RMRP靶向si RNA56-57
• 3.6.2 梯度转染，确认pc DNA3.1-RMRP表达质粒和靶向si RNA最佳转染浓度57-58
• 3.6.3 验证pc DNA3.1-RMRP表达质粒和靶向si RNA转染效率58-61
• 3.7 沉默和上调RMRP表达对胃癌细胞生长的影响61-69
• 3.7.1 沉默和上调胃癌细胞RMRP表达后，实时细胞分析仪检测细胞增殖变化61-63
• 3.7.2 沉默和上调胃癌细胞RMRP表达后，，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化63-66
• 3.7.3 沉默和上调胃癌细胞RMRP表达后，流式细胞仪检测细胞周期的变化66-68
• 3.7.4 细胞平板克隆形成试验（plate colony formation assay）68-69
• 3.8 建立裸鼠移植瘤动物模型，体内验证RMRP对胃癌细胞生长的影响69-70
• 3.8.1 沉默和上调胃癌细胞MGC-803的RMRP表达后，分析其对裸鼠肿瘤生长的影响69-70
• 3.8.2 分析裸鼠接种肿瘤后，血浆RMRP水平的变化70
• 3.9 分析RMRP影响细胞周期的分子机制70-73
• 3.9.1 mi Rcode软件预测RMRP下游mi RNA靶标70-71
• 3.9.2 构建RMRP - mi R206 Cyclin D2调控网络71
• 3.9.3 沉默和上调RMRP后，检测Cyclin D2表达水平变化71-73
• 3.10 其它长链非编码RNA AA174084、HMlinc RNA717与胃癌关系的研究73-74
• 讨论74-79
• 全文小结79-80
• 参考文献80-84
• 附录A 缩略词84-86
• 附录B 综述86-103
• 参考文献97-103
• 附录C103-104
• 在学研究成果104-106
• 致谢106

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