癌基因DEK调节VEGF表达及其在血管生成中作用的初步研究

发布时间：2017-08-14 10:07

  本文关键词：癌基因DEK调节VEGF表达及其在血管生成中作用的初步研究

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【摘要】：肿瘤细胞通过血管获得营养,同时血管也为肿瘤转移提供通道。抑制肿瘤血管生成,可以在一定程度上抑制肿瘤生长和转移。血管内皮生长因子(VEGF)在调控血管生成中发挥重要作用,也是调节肿瘤血管生长及肿瘤细胞转移的关键因子。癌基因DEK在多种肿瘤中高表达,DEK过度表达与多种癌症的不良预后相关。目前DEK在调节肿瘤血管生成中的作用尚不明确。本研究探讨了癌基因DEK调控VEGF表达及在血管生成中的作用,为进一步深入研究DEK在肿瘤发生发展中的作用奠定实验基础。本研究包括以下内容:1.癌基因DEK对VEGF表达的影响及在调控血管生成中作用的研究通过荧光素酶活性、RT-PCR检测DEK对VEGF表达的影响,并观察DEK在HUVEC细胞生长、迁移及体外成管中的作用。利用鸡胚绒毛尿囊膜模型,观察DEK对体内血管形成的影响。结果表明:DEK激活VEGF的转录,增加VEGF表达,并促进HUVEC细胞的生长、迁移及体内、外血管生成。2.癌基因DEK通过VEGF影响血管内皮细胞的生物学活性研究利用VEGF中和性抗体封闭DEK过表达乳腺癌细胞ZR75-1分泌的VEGF,以其上清作为条件培养基培养HUVEC,观察DEK对HUVEC细胞的生长,迁移及体外血管生成的作用,并利用鸡胚绒毛尿囊膜模型,观察其对体内血管形成的影响。结果显示:DEK通过VEGF促进HUVEC细胞的生长、迁移及体内、外血管生成。3.癌基因DEK促进VEGF表达与HIF-1a相关性的研究在缺氧及敲低HIF-1a表达的条件下,检测DEK对VEGF表达的影响,并观察在敲低HIF-1a表达时,DEK对HUVEC细胞生物学活性的影响。结果表明:DEK部分依赖于HIF-1a促进HUVEC细胞的生长、迁移及体内、外血管生成。4.癌基因DEK调控VEGF分子机制的初步研究利用CHIP、EMSA寻找DEK与VEGF启动子的结合点,结果显示:DEK通过DRE和HRE募集于VEGF启动子,HIF-1a只募集于HRE调控VEGF的转录活性。5.癌基因DEK与HIF-1a的相互关系研究通过GST pull-down和免疫共沉淀确认DEK与HIF-1a的相互关系,结果表明:在生理条件下,DEK与HIF-1a存在相互作用。结论:1.癌基因DEK通过促进VEGF表达影响血管生成;2.癌基因DEK可与VEGF启动子结合,其对VEGF表达的调控部分依赖于缺氧诱导因子HIF-1a。
【关键词】：癌基因DEK 血管内皮生长因子VEGF 缺氧诱导因子HIF-1a 血管生成
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文缩写词表12-13
• 第一章 引言13-23
• 1.1 血管内皮因子（VEGF）与肿瘤血管生成13-17
• 1.1.1 VEGF的生物学特征13-14
• 1.1.2 VEGF的表达调控14-15
• 1.1.3 血管生成与肿瘤15-16
• 1.1.4 VEGF与乳腺癌相关研究16-17
• 1.2 缺氧诱导因子（HIF-1）与肿瘤血管生成17-20
• 1.2.1 HIF-1 概述17-18
• 1.2.2 缺氧与血管形成18-20
• 1.3 DEK与乳腺癌相关研究20-23
• 1.3.1 DEK蛋白概述20-21
• 1.3.2 DEK与肿瘤21-23
• 第二章 癌基因DEK对VEGF表达的影响及在调控血管生成中的功能研究23-35
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 细胞株23
• 2.1.2 质粒23
• 2.1.3 试剂23-24
• 2.1.4 细胞培养试剂和转染试剂24
• 2.1.5 抗体24
• 2.1.6 主要实验仪器24
• 2.1.7 常用溶液配方24-25
• 2.2 方法25-30
• 2.2.1 慢病毒包装及哺乳动物细胞稳定克隆的制备25-26
• 2.2.2 哺乳动物细胞的转染26
• 2.2.3 荧光素酶 β-半乳糖苷酶活性测定26-27
• 2.2.4 总RNA的提取27
• 2.2.5 反转录PCR（RT-PCR）27-28
• 2.2.6 Real-time PCR28
• 2.2.7 细胞全蛋白提取28
• 2.2.8 Western blot分析28-29
• 2.2.9 细胞生长曲线测定29
• 2.2.10 细胞划痕实验29
• 2.2.11 HUVEC细胞成管实验29-30
• 2.2.12 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验30
• 2.3 结果与分析30-34
• 2.3.1 癌基因DEK对VEGF表达的影响30-31
• 2.3.2 DEK过表达及敲低稳定细胞系的建立31
• 2.3.3 DEK促进VEGF m RNA的表达31-32
• 2.3.4 DEK促进HUVEC细胞的生长和迁移32-33
• 2.3.5 DEK促进体内外血管的形成33-34
• 2.4 小结34-35
• 第三章 癌基因DEK通过VEGF影响血管内皮细胞的生物学活性35-39
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 细胞株35
• 3.1.2 细胞培养试剂和转染试剂35
• 3.1.3 抗体35
• 3.1.4 主要实验仪器35-36
• 3.2 方法36
• 3.2.1 细胞生长曲线测定，划痕实验等36
• 3.3 结果与分析36-38
• 3.3.1 DEK通过VEGF促进HUVEC细胞生长36-37
• 3.3.2 DEK通过VEGF促进HUVEC细胞迁移37
• 3.3.3 DEK通过VEGF促进体外成管37-38
• 3.3.4 DEK通过VEGF促进体内血管形成38
• 3.4 小结38-39
• 第四章 癌基因DEK调控VEGF的分子机制39-64
• 4.1 材料39-42
• 4.1.1 引物合成及序列测定39
• 4.1.2 菌株与细胞株39
• 4.1.3 质粒39-40
• 4.1.4 试剂40
• 4.1.5 细胞培养试剂和转染试剂40
• 4.1.6 抗体40-41
• 4.1.7 主要实验仪器41
• 4.1.8 常用溶液配方41-42
• 4.2 方法42-47
• 4.2.1 哺乳动物细胞的转染，荧光素酶 β-半乳糖苷酶活性测定等42
• 4.2.2 GST融合蛋白的诱导表达42
• 4.2.3 GST融合蛋白的纯化42
• 4.2.4 GST沉淀（pull-down）分析42-43
• 4.2.5 免疫共沉淀IP43
• 4.2.6 内源性免疫共沉淀43-44
• 4.2.7 染色质免疫共沉淀（CHIP）44-45
• 4.2.8 EMSA45-47
• 4.3 结果与分析47-62
• 4.3.1 缺氧条件下DEK促进VEGF的表达47-49
• 4.3.2 DEK促进VEGF表达与HIF-1a相关性的研究49-50
• 4.3.3 DEK部分依赖于HIF-1a促进血管内皮细胞的生物学活性50-53
• 4.3.4 确定DEK与VEGF启动子的结合位点53-58
• 4.3.5 DEK与HIF-1a存在相互作用58-62
• 4.4 小结62-64
• 第五章 讨论64-66
• 第六章 结论66-67
• 参考文献67-71
• 硕士期间研究成果71-72
• 致谢72

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本文编号：672092