MTA1蛋白在人髓母细胞瘤的表达及调控侵袭转移机制的研究

发布时间：2017-08-15 12:43

  本文关键词：MTA1蛋白在人髓母细胞瘤的表达及调控侵袭转移机制的研究

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【摘要】：研究背景：髓母细胞瘤(Medulloblastoma, MB)是儿童和青年最常见的恶性脑肿瘤之一,主要发生在后颅窝,常见于小脑蚓部或第四脑室,具有治愈率低、死亡率高、预后差的特点。髓母细胞瘤具有极强的浸润性和转移性,其肿瘤细胞可向临近部位的脑组织浸润、转移,导致第四脑室闭塞进而引起颅内压增高的临床症状；同时,肿瘤细胞也可通过脑脊液途径沿硬脊膜下腔播散侵犯脊髓；另有研究表明,大约有5%的髓母细胞瘤也可转移到长骨、肺等身体的其他部位。直以来,外科手术辅以放化疗一直被认为是治疗髓母细胞瘤主要方式,并且使得患者预后情况得到了明显的改善,但髓母细胞瘤患者的5年总体生存率仍较低。因此,研究髓母细胞瘤侵袭和转移的分子生物机制,对临床探索出新的治疗策略有着非常重要的意义。肿瘤转移相关基因(Metastasis-Associated gene, MTA)是一个与肿瘤转移密切相关的基因家族,可表达于肿瘤中,主要由3类基因(MTA1、MTA2、MTA3)6个亚型(MTA1、MTAls、MTA1-ZG29p、MTA2、 MTA3和MTA3L)组成。众所周知,MTA蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭性和肿瘤患者的预后情况有着密切的联系。大量研究表明,MTA1通过影响蛋白质的泛素化在调控蛋白的稳定状态、DNA损伤反应以及在人血液和上皮性恶性肿瘤中高表达状态等发挥重要作用。另外,MTA1利用组蛋白去乙酰基和核小体重塑的方式调控上皮-间质转化、DNA损伤反应、肿瘤形成以及炎症反应的作用也得到了证实。近年来,关于MTA1蛋白可能参与多种恶性肿瘤发生发展的报道越发增多。因此,MTA1蛋白有可能成为新的诊断和治疗肿瘤的最佳通路和潜在治疗靶点。本实验,我们首先利用免疫组化明确MTA1在人髓母细胞瘤及瘤旁正常组织中的差异表达,然后通过RT-PCR,粘附实验等方式明确MTA1在在髓母细胞瘤的侵袭和转移的作用,为临床治疗髓母细胞瘤提供新思路。目的：探讨肿瘤转移相关基因(Metastasis-associated gene 1, MTA1)在髓母细胞瘤(Medulloblastoma, MB)中侵袭、转移的作用及其机制。方法：标本收集：收集南方医科大学珠江医院神经外科和东莞市人民医院神经外科从2010年12月至2014年12月收治的手术切除和病理确诊的29例髓母细胞瘤患者中,女性14例(48.3%),男性15例(51.7%),年龄：5-36年,平均年龄14.17±8.17岁。纳入标准：(1)临床资料完整；(2)病理诊断确定为髓母细胞瘤；(3)术中获取的肿瘤组织及瘤旁正常组织分别作为实验组与对照组。排除标准： (1)患者临床资料不完整；(2)伴有其它的原发肿瘤。每例患者的标本离体后立即用10%甲醛固定、常规石蜡包埋,作4μm连续切片供检测用。免疫组织化学染色检测MTA1蛋白表达：采用免疫组织化学法检测所有标本中MTA1蛋白表达水平,具体步骤按说明书操作,手术切术的肿瘤组织及瘤旁正常组织经10%中性甲醛溶液固定后,石蜡包埋切片常规脱蜡水化,采用枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)、0.3% H202分别进行抗原修复和阻断内源性过氧化物酶活性,然后滴加按1：200稀释后的鼠抗人MTA1多克隆抗体并4℃孵育过夜,第2天取出室温恢复30 min, PBS清洗后,滴加兔抗鼠二抗并37℃作用30 min,PBS清洗后,DAB染色,复染后封片,同时我们以PBS代替一抗作阴性对照；结果,以瘤细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞,并根据双评分半定量方法进行评分：染色强度(无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色或棕褐色为2分),阳性细胞百分比(阴性为0分,20%为1分,20%-50%为2分,50%为3分),而且染色强度评分加阳性细胞百分比评分所得结果≥2时,即为免疫反应(+),否则为(.)。MTA1-siRNA转染Daoy细胞：我们从ATCC公司购得髓母细胞瘤Daoy细胞株,同时化学合成针对MTA1的小干扰序列即siRNA、无义对照序列niRNA、质粒载体Lipofectamine 2000,将Daoy置于DMEM培养基中,37℃、5%的CO2恒温箱内培养至对数生长期后,通过Lipofectamine 2000将化学合成的MTA1-siRNA及无义序列MTA1-niRNA转染Daoy细胞内,恒温箱内孵育48-96 h,同时以转染质粒载体作为空白对照组。RT-PCR检测MTA1 mRNA表达：Trizol法提取总RNA,利用紫外分光光度计(Qcontums)测纯度和浓度,取2μ.g总RNA,用逆转录酶进行反转录,取cDNA5μL作PCR扩增,94℃变性30 s,55℃退火40 s,72℃延长30s,扩增长度为210bp,最后利用凝胶电泳后分析结果,以MTA1和P-actin扩增带的吸光度比值来评价MTA1 mRNA的表达水平。Western blot检测MTA1蛋白表达：收集各组细胞,提取细胞蛋白、上样,通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品后转膜,室温封闭后加入稀释浓度为1：200的羊抗人MTA1多克隆抗体,4℃孵育过夜后,加入相应二抗,孵育、暗室曝光、显影、定影及分析,其中我们以β-actin作为内参标志物。细胞粘附能力实验：待转染48h后,将对数期生长的Daoy细胞利用胰蛋白酶消化法制成单细胞悬液,然后接种于Matrigel胶预处理的96孔板中,每孔加1×105细胞,并设3个平行孔,分别在孵育30min、60min、90min后用PBS洗涤以除去未黏附的细胞,采用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium, MTT)比色法检测570nm处的吸光度(A)值并计算粘附率,其公式为粘附率(%)=粘附于Matrigel上细胞的A值/总细胞A值×100%。细胞划痕实验：待转染48h后,将对数期生长的Daoy细胞利用胰蛋白酶消化法制成单细胞悬液并接种于6孔培养板中,待细胞长到完全融合时,用200μL黄色枪头在6孔板的底面上沿直线轻轻划痕制作细胞伤口模型,PBS冲洗2次后继续培养,分别于划痕后第8h、16h、24h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况并拍照。我们以细胞划痕愈合百分比表示细胞的迁移能力(0h的细胞划痕愈合为0%)。Transwell小室体外侵袭实验：将Transwell小室置于24孔板内,在每个下室内加入含有10%小牛血清的DMEM培养液500μL,上室加入200μL细胞悬液,每组设5个复孔,常规培养12h后取出Transwell小室,利用95%乙醇固定并采用棉拭子擦去小室内面的基质腔,然后通过4%多聚甲醛固定、HE染色,最后在显微镜下观察并拍照。统计分析：应用SPSS19.0统计软件包对数据进行统计学处理分析,计量资料以均数±标准差表示。两组数据间均数比较采用独立样本t检验,多组数据间均数比较采用One-Way ANOVA分析。计数资料以用百分比/率表示,比较采用卡方检验。全部数据均进行双边检验,P0.05为差异有统计学意义。结果：1.MTA1蛋白在髓母细胞瘤组织中的阳性表达率高于瘤旁正常组织的阳性表达率(P0.01)；2.MTA1-siRNA组中MTA1的表达水平较MTA1-niRNA组及对照组明显降低(均P0.05)；3.MTA1-siRNA组中MTA1蛋白量的表达显著低于MTA1-niRNA组及对照组(P0.05),而MTA1-niRNA组和对照组的MTA1蛋白表达量无明显差异(P0.05)；4.MTA1-siRNA组中细胞黏附率显著低于MTA1-niRNA处理组及对照组细胞黏附率(P0.05),而对照组及MTA1-niRNA组细胞粘附率差异无统计学意义(P0.05)；5.与对照组及MTA1-niRNA组相比,MTA1-siRNA组细胞的划痕愈合速度较慢,并出现未完全愈合现象；6.MTA1-siRNA组中穿过Transwell小室基底膜细胞数量明显低于MTA1-niRNA组及对照组(P0.05),而对照组和MTA1-niRNA处理组穿过基底膜细胞数目之间无明显差异(P0.05)。结论：髓母细胞瘤中MTA1蛋白表达水平升高,而且,抑制MTA1的表达可以降低髓母细胞瘤细胞的转移、侵袭及黏附能力。因此,MTA1可作为临床上治疗人髓母细胞瘤潜在的靶点。
【关键词】：肿瘤转移相关蛋白1 髓母细胞瘤 转移 侵袭 黏附 小干扰RNA
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-19
• 第一部分 MTA1蛋白在人髓母细胞瘤的表达19-26
• 1.1 实验仪器、材料和试剂19-21
• 1.2 实验方法21-23
• 1.3 结果23
• 1.4 附图23-26
• 第二部分 MTA1蛋白调控髓母细胞瘤侵袭转移机制的研究26-45
• 2.1 实验仪器、材料和试剂26-30
• 2.2 实验方法30-38
• 2.3 结果38-40
• 2.4 附图40-45
• 讨论45-52
• 结论52-53
• 参考文献53-58
• 综述58-66
• 参考文献62-66
• 中英文缩略词对照表66-67
• 攻读学位期间成果67-68
• 致谢68-69

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