工程化CTL凝胶预防直肠癌术后复发研究

发布时间：2017-08-16 06:23

  本文关键词：工程化CTL凝胶预防直肠癌术后复发研究

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【摘要】：研究背景目前,直肠癌已成为全世界范围内最为常见的一种恶性肿瘤,在中国的发病率近年来也迅速增长,成为城市发病率第一的恶性肿瘤。直肠癌手术治疗是对其根治的最有效方法,然而对部分低位直肠癌的手术却陷入两难境地,对于生活质量要求较高的患者,腹会阴联合根治术造成身体、心理创伤往往难以接受,而保肛手术存在根治不彻底、肿瘤复发率高的风险,术后常规的放、化疗又存在副作用大、术区粘连的弊端。我们希望能够找到一种术中应用的辅助治疗手段,在局部切除的同时,能够降低肿瘤的复发,消灭残存的恶性肿瘤细胞,同时还能减少放疗所带来的副作用。目前,过继细胞免疫治疗已成为治疗恶性肿瘤的第四种疗法,在临床得到广泛应用,也越来越凸显出其良好疗效,在综合治疗恶性肿瘤疾病中显现出巨大作用。该方法在提高患者自身免疫防御力及杀伤力的同时,积极消灭术后及放化疗后血液、组织内残留的恶性肿瘤细胞,以实现降低恶性肿瘤复发率、延长生存期的目标,有着副作用小、特异性强的优点。在体外培养的细胞毒性T淋巴细胞,具备靶向杀伤肿瘤细胞特点,有效控制肿瘤生长、复发及转移。国内外对于CTL细胞连续杀伤靶细胞的高效特点、抗原特异性特点、自身MHC限制性特点有很多研究,在多项临床试验中有稳定的抗肿瘤效果,静脉回输CTL细胞在临床也有实际应用。而将CTL细胞与含有大量水分利于营养物质运输及免疫活性细胞迁移、具有网格结构的凝胶材料结合构建类淋巴组织却在国际上没有报道,本实验室前期研究证实透明质酸钠与免疫活性细胞结合能够最大限度保持其活性并发挥最大杀伤能力。故本实验拟应用CTL细胞结合透明质酸钠凝胶构建工程化类淋巴组织,以观察其预防裸鼠直肠癌术后复发转移的疗效。研究目的建立裸鼠直肠癌局部切除模型,通过制备CTL透明质酸钠凝胶构建的工程化类淋巴组织,对CTL凝胶预防裸鼠直肠癌切除后复发情况进行分析,为CTL凝胶的临床应用奠定基础。研究方法：1、利用人结肠癌sw480细胞系建立裸鼠低位直肠癌模型,一周后利用外科能量平台进行切除,构建裸鼠低位直肠癌切除模型；2、提取健康人血液,密度梯度离心分离PBMCs,制备载荷sw480抗原的DC细胞及T细胞,两周后收获CTL细胞；3、稀释透明质酸钠凝胶,取CTL细胞1.8×10。,制备CTL凝胶待局部注射,将另一部分CTL细胞与无血清培养基混合,使细胞数达到6×107待尾静脉注射；4、实验组手术部位周围局部注射CTL凝胶,其中一组注射凝胶同时尾静脉注射CTL溶液；5、观察肿瘤复发转移情况,每日记录肿瘤生长变化情况,两周后处死全部裸鼠,术区拍照对比,肿瘤、肝、脾、肿大淋巴结称重,血液行血常规检查,血液及研磨后脾脏行流式细胞仪检测,肿瘤及周围组织标本送病理检查、免疫组化检查。6、统计分析效果评价。研究结果1、成功构建出裸鼠低位直肠癌模型及裸鼠低位直肠癌切除模型；2、手术切除+CTL凝胶+尾静脉注射组抑瘤率为89.45%,手术切除+CTL凝胶组82.21%,与其他三组比较差异显著；3、手术切除+CTL凝胶+尾静脉注射组肿瘤重量与手术切除+CTL凝胶组比较有差异(P0.05),与手术切除组、凝胶组及对照组相比差异显著(P0.01)；4、手术切除+CTL凝胶+尾静脉注射组淋巴细胞比例、血液中T细胞比例、脾指数均与其他三组差异显著(P0.01)；5、手术切除+CTL凝胶+尾静脉注射组及手术切除+CTL凝胶组复发率、转移率与手术切除组、凝胶组及对照组相比差异显著；6、病理结果提示手术切除+CTL凝胶+尾静脉注射组及手术切除+CTL凝胶组肿瘤切除原位无复发,无肿瘤组织残留,免疫组化检查显示其肿瘤切除部位周围有大量T细胞浸润,单纯凝胶组肿瘤周围大量T细胞浸润。研究结论1、本研究制备的裸鼠直肠癌模型及裸鼠直肠癌局部切除模型符合直肠癌病理特点,制瘤率高,模拟了手术切除的过程及术后病理生理学特点,具备了直肠癌局部切除的特征,具有操作性强、方法简便、可控性高的特点,对研究直肠癌手术及辅助治疗具有较高的应用价值；2、CTL凝胶能够有效抑制裸鼠直肠癌切除术后肿瘤复发、转移及种植,能够提升T淋巴细胞数量、增强机体免疫能力,有效杀伤肿瘤细胞,减轻炎症反应,减缓疾病进展；3、CTL凝胶联合手术及静脉输注CTL细胞对与直肠癌术后有良好疗效,减少术后粘连,有效杀伤残留肿瘤细胞,增强了CTL持续抗瘤效果,改善免疫环境,增强了单独手术及单独免疫过继治疗的效果,可以作为直肠癌手术辅助治疗手段。
【关键词】：细胞毒T淋巴细胞 透明质酸钠凝胶 直肠癌术后
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.37
【目录】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-20
• 参考文献17-20
• 第一章 裸鼠直肠癌切除模型建立20-29
• 第一节 实验材料20-22
• 1.1.1 实验动物及细胞株20
• 1.1.1.1 实验动物20
• 1.1.1.2 细胞株20
• 1.1.2 主要试剂20-21
• 1.1.3 主要仪器21-22
• 1.1.4 试剂配置22
• 第二节 实验方法22-24
• 1.2.1 人结直肠sw480肿瘤细胞复苏以及培养22-23
• 1.2.2 裸鼠直肠癌动物模型建立23
• 1.2.3 裸鼠直肠癌切除模型建立23-24
• 1.2.4 统计学分析24
• 第三节 实验结果24-26
• 1.3.1 裸鼠直肠癌模型建造情况24-25
• 1.3.2 裸鼠直肠癌局部切除模型建立情况25-26
• 第四节 讨论26-29
• 第二章 工程化CTL凝胶制备29-36
• 第一节 实验材料29-31
• 2.1.1 研究对象29
• 2.1.2 主要试剂29-30
• 2.1.3 主要实验仪器30-31
• 2.1.4 主要试剂配制方法31
• 第二节 实验方法31-33
• 2.2.1 密度梯度离心分离PBMCs31-32
• 2.2.2 DC细胞培养32
• 2.2.3 CTL细胞培养32
• 2.2.4 透明质酸钠凝胶制备32-33
• 2.2.5 工程化CTL凝胶制备33
• 第三节 结果33-35
• 2.3.1 CTL细胞培养结果33
• 2.3.2 CTL细胞流式检测结果33-34
• 2.3.3 光镜下工程化CTL凝胶中CTL细胞生长情况34-35
• 第四节 讨论35-36
• 第三章 工程化CTL凝胶预防直肠癌局部切除术后复发的实验研究36-56
• 第一节 实验材料36-39
• 3.1.1 实验动物及细胞株36-37
• 3.1.2 主要试剂37-38
• 3.1.3 主要仪器38-39
• 第二节 实验方法39-43
• 3.2.1 CTL细胞培养及取用39
• 3.2.2 裸鼠直肠癌模型建立39
• 3.2.3 各组治疗干预方法39-41
• 3.2.4 观察各组裸鼠状态及肿瘤生长情况41
• 3.2.5 裸鼠眼球取血、测血常规41
• 3.2.6 观察肿瘤复发及转移情况,淋巴节转移情况41
• 3.2.7 测定脾指数、脾脏淋巴细胞提取41-42
• 3.2.8 测量外周血、脾脏免疫细胞含量42
• 3.2.9 组织病理学检查42
• 3.2.10 计算抑瘤率42-43
• 3.2.11 统计学分析43
• 第三节 结果43-53
• 3.3.1 各组裸鼠肿瘤生长情况43-44
• 3.3.2 肿瘤重量44-45
• 3.3.4 各组抑瘤率比较45
• 3.3.5 各组脾指数比较45-46
• 3.3.6 复发与转移情况46-48
• 3.3.7 病理HE染色切片情况48-49
• 3.3.8 免疫组化检查49-50
• 3.3.9 血液结果50-51
• 3.3.10 各组裸鼠外周血及脾脏免疫细胞含量比较51-53
• 第四节 讨论53-56
• 第四章 结论56-57
• 参考文献57-62
• 综述62-67
• 参考文献65-67
• 硕士期间发表论文情况67
• 获得奖励情况67-68
• 致谢68-69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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2 杜晓辉,郑伟,宋少柏,孔庆龙;结直肠癌患者血清血管内皮生长因子含量分析及其临床意义[J];解放军医学杂志;2000年06期

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中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 邹振玉;蟾皮抗肿瘤活性组分筛选及荷人结肠癌裸鼠淋巴道化疗的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年

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本文编号：681829