Rapamycin联合SAHA对人肺腺癌细胞的放疗增敏效应及机制

发布时间：2017-08-16 06:03

  本文关键词：Rapamycin联合SAHA对人肺腺癌细胞的放疗增敏效应及机制

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【摘要】：目的:观察雷帕霉素(Rapamycin)联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对人肺腺癌A549细胞放疗敏感性的影响并探讨可能的分子机制。方法:1.Rapamycin、SAHA联合用药剂量确定:体外培养A549细胞,给予不同浓度Rapamycin(0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1000nmol/L)、SAHA(0μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)以及两药交叉联合处理24h,MTT法检测细胞增殖抑制率,计算两药联合作用A549细胞24h后10%细胞生长抑制的浓度(IC10)。2.观察Rapamycin联合SAHA对A549细胞放疗敏感性影响:A549细胞给予IC10处理24h,后给予4Gy X线照射,采用细胞克隆形成实验检测A549细胞增殖活性。3.Rapamycin联合SAHA放疗增敏机制研究(1)检测Rapamycin联合SAHA对A549细胞放疗后DSBs修复影响:A549细胞给予IC10处理24h,后给予4Gy X线照射,采用Western blot和免疫荧光检测放疗后1h和24hγ-H2AX蛋白表达变化和焦点形成;采用Western blot检测放疗后4h Rad51、Ku80、Ku70蛋白表达变化;采用RT-q PCR检测放疗后4h Rad51m RNA、Ku80 m RNA、Ku70 m RNA表达变化。(2)检测Rapamycin联合SAHA对A549细胞自噬和乙酰化影响:A549细胞给予Rapamycin或/和SAHA处理24h,以及4Gy X线照射,采用透射电镜检测A549细胞自噬体形成情况;Western blot检测LC3、p62表达变化。A549细胞给予SAHA、Rapamycin+SAHA处理24h,采用Western blot检测乙酰化组蛋白H3(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)表达变化。结果:1.Rapamycin、SAHA联合用药剂量确定:Rapamycin和SAHA对A549细胞生长均具有抑制作用,呈剂量依赖性;联合用药组对A549细胞的抑制率较单独用药组增高(p0.05)。两药联合剂量浓度IC10=Rapamycin:100 nmol/L;SAHA:2.5μmol/L。2.Rapamycin联合SAHA影响A549细胞放疗敏感性:细胞克隆形成实验结果发现,CTL组、IR组、IR+R组、IR+S组、IR+R+S组细胞存活分数(survival fraction,SF)分别为100.0±0.00%、67.8±6.32%、43.1±7.18%、58.5±1.17%、21.1±7.01%,相比IR组,IR+R+S组SF下降最明显(p0.05)。3.Rapamycin联合SAHA影响A549细胞DSBs修复过程:(1)Western blot和免疫荧光检测结果发现,相比CTL组,放疗后1h各实验组γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦点表达增加(p0.05),组间无差异(p0.05),24h后各实验组γ-H2AX蛋白和γ-H2AX焦点表达均有所下降,IR+R+S组下降幅度最小(p0.05)。(2)Western blot检测结果发现,相比CTL组,IR组Rad51蛋白表达增加(p0.05),Ku80、Ku70蛋白表达无显著差异(p0.05)。相比IR组,IR+R组、IR+R+S组Rad51蛋白表达下降(p0.05),IR+R组、IR+S组、IR+R+S组Ku80蛋白表达下降(p0.05),IR+R+S组Ku70蛋白表达下降(p0.05);相比各实验组IR+R+S组Rad51、Ku80、Ku70蛋白表达下降最大(p0.05)。(3)RT-q PCR检测结果发现,相比CTL组,放疗后4h IR组、IR+R组Rad51、Ku80、Ku70 m RNA表达均有所增加(p0.05),组间无差异(p0.05)。相比IR组,IR+S组、IR+R+S组Rad51、Ku80、Ku70 m RNA表达均有不同程度下降(p0.05),组间无差异(p0.05)。4.Rapamycin联合SAHA影响A549细胞自噬和乙酰化水平:(1)透射电镜结果发现,Rapamycin、放疗均能使A549细胞自噬体形成增加,Rapamycin作用最为明显。Western blot结果发现,Rapamycin、放疗可诱导LC3II蛋白表达增加,LC3II/LC3I比值增高,p62蛋白表达降低。(2)Western blot结果发现,SAHA可诱导Ac-H3表达增多。结论:1.Rapamycin联合SAHA可增加A549细胞放疗敏感性。2.Rapamycin联合SAHA放疗增敏的机制可能通过上调自噬降解乙酰化DSBs修复蛋白影响DSBs修复。
【关键词】：自噬 乙酰化 A549细胞 放疗敏感性 DNA双链断裂损伤
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文缩略词表11-12
• 第1章 引言12-16
• 第2章 材料与方法16-29
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 主要仪器16-17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 主要试剂的配制18-19
• 2.2.2 去RNA酶的处理19-20
• 2.2.3 细胞培养与照射条件20-21
• 2.2.4 MTT法检测细胞增殖抑制率21
• 2.2.5 细胞克隆形成实验检测细胞增殖21-22
• 2.2.6 免疫荧光检测 γ-H2AX蛋白表达变化22-23
• 2.2.7 Western blot法检测蛋白表达的变化23-25
• 2.2.8 RT-q PCR检测修复分子m RNA的表达变化25-27
• 2.2.9 电镜检测自噬体变化27-28
• 2.2.10 数据的统计分析28-29
• 第3章 结果29-38
• 3.1 Rapamycin、SAHA联合用药剂量确定29-30
• 3.2 Rapamycin联合SAHA对A549细胞放疗敏感性的影响30-31
• 3.3 Rapamycin联合SAHA对A549细胞放疗增敏的机制31-38
• 3.3.1 Rapamycin联合SAHA对DSBs修复通路的影响31-35
• 3.3.2 Rapamycin、SAHA可能通过上调自噬清除乙酰化DSBs修复蛋白35-38
• 第4章 讨论38-42
• 4.1 Rapamycin联合SAHA增加A549细胞放疗敏感性38-39
• 4.2 Rapamycin联合SAHA通过影响DSBs修复通路增加放疗敏性39-40
• 4.3 Rapamycin联合SAHA可能通过上调自噬降解乙酰化DSBs修复蛋白影响DSBs修复40-42
• 第5章 结论42-43
• 5.1 结论42
• 5.2 进一步工作的方向42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 综述 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在非小细胞肺癌中的研究进展49-58
• 参考文献55-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 韩宝林;王轩;李立芳;王永志;王广舜;;γH2AX对肺癌放射敏感性的预测效果[J];天津医药;2014年09期

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本文编号：681717