c1orf109结合cyclin D1启动子序列特征研究

发布时间：2017-08-16 09:27

  本文关键词：c1orf109结合cyclin D1启动子序列特征研究

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【摘要】：课题组在前期研究中发现了一种新型蛋白c1orf109。在之前的工作中,发现此蛋白本身存在多个磷酸化位点,是CK激酶的底物。细胞系蛋白水平分析结果则显示c1orf109蛋白的水平在多个癌细胞系内显著增加,说明其表达与细胞的癌变进程可能存在潜在联系。在前期的co-IP实验中发现c1orf109蛋白具有与cyclin D1启动子结合的能力。为了验证这种结合能力是否是c1orf109蛋白调控cyclin D1基因表达的途径,从而是否能够解释c1orf109在细胞内的水平和癌细胞增殖之间的关系,本研究主要研究了c1orf109对cyclin D1启动子序列是否会产生作用并影响cyclin D1蛋白的表达,以及这一作用若存在的情况下其在cyclin D1启动子序列上的主要作用区域方面的内容。实验中首先使用了生物信息学手段对cyclin D1启动子序列进行了分析,并和已经同c1orf109蛋白结合的序列区域进行了对比,最终将cyclin D1启动子分为了六个片段。这些cyclin D1启动子片段随后被连入PGL-3 basic荧光报告质粒内,得到的重组质粒在转染入He La细胞后,受内源性c1orf109蛋白刺激表达了不同水平的荧光素酶。同时为了控制He La细胞内的c1orf109蛋白的表达水平,实验使用了RNA干扰的方法,并通过western blot检测发现所使用si RNA能够降低细胞内c1orf109蛋白的水平。最后,荧光报告重组质粒被转染入通过si RNA干扰造成c1orf109水平不同的几组He La细胞内,并检测了荧光素酶的表达水平。实验结果显示重组了-881-15bp和-316-15bp的荧光报告质粒所表达的荧光素酶水平较高,且受c1orf109水平下降而出现的下降最为明显。这些结果证明了c1orf109对cyclin D1基因表达上调的作用,并确定了这一过程的机理是通过c1orf109蛋白同cyclin D1启动子序列的相互作用达成的。实验最终确定了c1orf109在cyclin D1启动子序列上能够产生作用的大致范围,为进一步明确这种调控表达的机制,并为阐明c1orf109作用的转录调控元件序列信息提供了线索。
【关键词】：c1orf109 cyclin D1 启动子 基因表达调控
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R730.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 绪论8-20
• 1.1 研究背景8-9
• 1.2 研究现状9-18
• 1.2.1 cyclin D1 的研究进展9-12
• 1.2.2 c1orf109 功能和表达的研究12-13
• 1.2.3 转录因子与启动子相互作用研究的主要手段和现状13-18
• 1.3 本文的主要研究内容18
• 1.4 技术路线18-20
• 第2章 实验方法和实验材料20-27
• 2.1 引言20
• 2.2 实验材料20-22
• 2.2.1 细胞系20
• 2.2.2 菌株和重组体20-21
• 2.2.3 抗体21
• 2.2.4 常用缓冲液及其他试剂21-22
• 2.2.5 主要仪器设备22
• 2.2.6 主要软件22
• 2.3 实验方法22-26
• 2.3.1 启动子序列分析22-23
• 2.3.2 PCR实验23
• 2.3.3 限制性内切酶双酶切实验23
• 2.3.4 DNA连接酶连接实验23
• 2.3.5 重组质粒转化实验23
• 2.3.6 质粒提取23-24
• 2.3.7 siRNA转染实验24
• 2.3.8 免疫印迹实验24-25
• 2.3.9 琼脂糖凝胶电泳25
• 2.3.10 细胞传代培养25
• 2.3.11 细胞的裂解25
• 2.3.12 重组质粒转染细胞实验25-26
• 2.3.13 荧光素酶水平检测26
• 2.4 本章小结26-27
• 第3章cyclin D1 启动子重组质粒的构建27-38
• 3.1 引言27
• 3.2 cyclin D1 启动子序列分析27-29
• 3.3 重组质粒的构建和筛选29-36
• 3.3.1 引物的设计29-32
• 3.3.2 重组质粒的构建32-34
• 3.3.3 重组质粒的筛选34-36
• 3.4 重组质粒表达荧光素酶效果的检验36
• 3.5 本章小结36-38
• 第4章 重组质粒转染细胞荧光素酶表达实验38-47
• 4.1 引言38
• 4.2 siRNA干扰c1orf109 蛋白表达水平38-40
• 4.3 重组质粒转染和荧光素酶的检测40-45
• 4.4 本章小结45-47
• 结论47
• 展望47-48
• 参考文献48-53
• 附录53-58
• 致谢58

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本文编号：682526