青蒿琥酯对宫颈癌U14细胞体内外生长增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表达的影响

发布时间：2017-08-16 17:28

  本文关键词：青蒿琥酯对宫颈癌U14细胞体内外生长增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表达的影响

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【摘要】：目的:目前宫颈癌发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中占第二位,发病年龄逐年降低,严重危害女性身心健康。宫颈癌的治疗模式仍以手术为主,放化疗为辅。但手术创伤大,放化疗不良反应明显,且均可进一步损伤机体免疫功能。为此,寻找既能杀伤宫颈癌细胞又对患者免疫功能无加重损害的治疗方法已成为研究关注点。青蒿琥酯是一种公认的抗疟类药物,但研究发现其对结直肠癌、肝癌、卵巢癌等均具有明显的多靶点抗瘤活性。本研究通过体内外实验分析青蒿琥酯(ART)对小鼠宫颈癌U14细胞生长增殖及移植瘤小鼠免疫功能的影响,从抑制U14细胞增殖及逆转肿瘤免疫抑制的角度探讨青蒿琥酯的抗宫颈癌作用机制,为其在临床广泛应用提供相应理论支持。方法:1 MTT法分析ART对U14细胞体外生长增殖的影响:U14细胞以不同的细胞浓度(2.5×104/m L、2×105/m L、1.0×106/m L)进行培养,采用MTT法测定培养不同时间(12h、24h、36h、48h、60h、72h)后细胞生长增殖的A492值,确定U14细胞最佳接种浓度及培养时间。以确定的接种浓度及培养时间作为实验条件,检测不同浓度(4.69ug/m L-600ug/m L)青蒿琥酯对U14细胞体外增殖的抑制作用,并计算相对抑制率。2 U14移植瘤小鼠动物模型的建立及实验分组:以5×107/m L U14细胞悬液,接种于小鼠左后肢近背部皮下(0.2m L/只)制备小鼠移植瘤模型。成瘤且瘤直径5mm的小鼠进行后续实验。将造模成功的移植瘤小鼠随机分为3组:1、肿瘤对照组;2、ART治疗组;3、顺铂(DDP)对照组,每组80只。同时设立同周龄健康的无移植瘤小鼠作为正常对照组。连续治疗7日后,各组再随机分为4组,每组20只,分别于第10d、20d、30d、40d处死。3给药方法:小鼠肿瘤直径5mm时开始给药,共治疗7d。根据人体使用剂量换算,ART治疗组小鼠肌肉注射ART(20mg/kg/d,0.2m L/次);DDP对照组小鼠腹腔注射顺铂(2mg/kg/d,0.2m L/次);肿瘤对照组及正常对照组小鼠给予等量的0.9%生理盐水肌注。4小鼠移植瘤生长状况观察:从接种肿瘤细胞之日起每日观察小鼠一般情况(精神、饮食、体重、活动、毛发、皮肤等)及移植瘤生长情况。每10d测小鼠体重、移植瘤的最长径和最短径,计算肿瘤体积;处死日剥瘤称取瘤重,计算抑瘤率。观察各组小鼠存活天数,并计算生命延长率。5 MTT法检测脾T淋巴细胞诱导转化:小鼠处死日无菌取脾称量脾重,计算脾指数,行小鼠脾T淋巴细胞ConA诱导转化实验,计算T淋巴细胞体外刺激指数SI。6 ELISA法测定小鼠血清免疫抑制分子表达:小鼠处死日当天收集血清,严格按ELISA试剂盒操作,检测各组小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量。结果:1 U14细胞培养浓度及培养时间的确定初始培养浓度为2×105/m L时,生长增殖曲线良好而稳定,于36h完全覆盖瓶底,48h后培养液开始变黄,pH值逐渐降低,确定此初始浓度下培养36h为最佳培养条件。2 ART对U14细胞体外生长增殖的影响与未经ART作用的肿瘤细胞对照组A492值(0.913±0.265)相比,浓度在37.5ug/m L-600ug/m L之间的ART作用后可使U14细胞生长增殖的A492值呈渐进性显著降低(分别为0.688±0.097、0.678±0.172、0.519±0.086、0.418±0.062、0.063±0.039,均P0.05),相对抑制率呈递进性升高(分别为24.64%、25.74%、43.15%、54.22%、93.10%)。而当ART作用浓度≤18.75ug/m L时,A492值与未经ART作用的肿瘤细胞对照组相比无明显差异。相关性分析显示,ART作用浓度与A492值之间呈显著负相关(r=-0.971,P=0.000),与相对抑制率之间呈显著正相关(r=0.988,P=0.000)。3 ART对小鼠移植瘤生长状况的影响小鼠皮下接种U14细胞3-5天后成瘤,成瘤率100%。局部皮肤于接种后10d内呈破溃、流脓等明显的炎症反应。肿瘤对照组小鼠精神萎靡,进食量少、睡眠较差,晚期呈消瘦状态,体重与正常对照组相比显著下降(均P0.05)。DDP对照组小鼠反应差,毛发晦暗无光泽,食欲差,排便、排尿次数少,呈消瘦状态,体重与正常对照组相比显著下降(均P0.05),且与肿瘤对照组相比10d组体重显著降低(P0.05),20d、30d、40d组相比均无明显差异。ART治疗组小鼠精神、饮食、睡眠等均较正常对照组小鼠无显著差异,各时间段小鼠体重较肿瘤对照组及DDP对照组均有显著回升(均P0.05),与正常对照组小鼠相比20d、40d组体重显著降低(均P0.05),10d、30d组体重无明显改变。各组小鼠体重大致呈现为DDP对照组肿瘤对照组ART治疗组正常对照组的总体趋势。与肿瘤对照组相比,各时间段内两治疗组小鼠瘤体积有下降趋势,DDP对照组小鼠在第10d时瘤体积明显低于肿瘤对照组(P0.05),其他时间段比较均无统计学差异;DDP对照组小鼠瘤体积较ART治疗组下降明显,但差异不显著。与肿瘤对照组小鼠各时间段瘤重相比,两治疗组均较其明显下降(均P0.05),DDP对照组瘤重于第10d明显低于ART治疗组(P0.05)。瘤体积、瘤重呈现为DDP对照组ART治疗组肿瘤对照组的总体趋势。DDP对照组抑瘤率在各个时间段内均较ART治疗组高。ART治疗组及DDP对照组小鼠生存时间与肿瘤对照组小鼠(38.0±2.79)d相比,均明显延长(均P0.05);ART治疗组生存时间(44.8±3.25)d较DDP对照组(47.3±3.89)d偏低,差异有统计学意义(P0.05)。小鼠生命延长率DDP对照组(24.47%)高于ART治疗组(17.89%)。4 ART对小鼠脾淋巴细胞诱导增殖的影响肿瘤对照组及两治疗组脾指数随时间推移均有降低趋势。肿瘤对照组小鼠在第10d时脾指数较正常对照组明显增高(P0.05),其他时间点均有不同程度降低,但与正常对照组相比差异不显著(均P0.05)。DDP对照组在第10d脾指数较正常对照组明显升高(P0.05),在第40d时值较正常对照组显著降低(P0.05),在20d、30d与正常对照组相比无差异;其各时间段值与肿瘤对照组相比均有所降低,在第40d时两组相比有明显差异(P0.05)。ART治疗组从第20d开始脾指数较DDP对照组有一明显回升(P0.05),且在第20d时显著高于肿瘤对照组(P0.05),在第10d、20d时较正常对照组显著增高(P0.05)。自20d后脾指数值呈现为DDP对照组肿瘤对照组正常对照组ART治疗组的总体趋势。肿瘤对照组及DDP对照组第20d、30d、40d的T淋巴细胞体外刺激指数SI明显低于正常对照组(均P0.05),DDP对照组第10d、20d的SI值明显低于肿瘤对照组(均P0.05)。ART治疗组第20d、30d、40d的SI值较肿瘤对照组明显回升(均P0.05);第10d、20d、40d时与DDP对照组相比SI也明显回升(均P0.05);第30d时SI值较正常对照组明显降低(P0.05),其他时间段两组比较均无差异(均P0.05)。自20d起SI值大致呈现为DDP对照组肿瘤对照组ART治疗组正常对照组的总体趋势。5 ART对小鼠血清免疫抑制分子表达的影响与正常小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量相比,肿瘤对照组及两治疗组中各时间段内上述含量均明显升高(P0.05)。经ART、DDP治疗后的小鼠血清中IL-4、IL-6含量与肿瘤对照组相比无明显差别(均P0.05)。DDP对照组与肿瘤对照组相比,IL-10含量无明显差异;ART治疗后,小鼠血清中IL-10含量较肿瘤对照组及DDP对照组明显降低(均P0.05)。两治疗组小鼠血清中TGF-β1、PGE2含量与肿瘤对照组相比较均明显降低(均P0.05),且ART治疗组中TGF-β1、PGE2含量均低于DDP对照组(均P0.05)。结论:1 ART有抑制宫颈癌U14细胞体内外增殖的作用,且随着ART作用浓度的增加,抑制作用逐渐增强。2 ART可通过增强U14荷瘤小鼠T淋巴细胞功能发挥抗瘤活性。3 ART通过下调U14荷瘤小鼠血清中IL-10、TGF-β1、PGE2分泌而有效逆转肿瘤免疫抑制,从而发挥针对宫颈癌的抗瘤活性。4 ART及DDP对U14移植瘤生长均有抑制作用,但ART对T淋巴细胞功能促进作用及下调免疫抑制分子的作用均优于DDP,且用药后荷瘤小鼠耐受性强于DDP。
【关键词】：青蒿琥酯 宫颈癌 U14 细胞增殖 免疫抑制分子 小鼠
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文缩写14-15
• 前言15-16
• 材料与方法16-20
• 结果20-23
• 附图23-33
• 附表33-40
• 讨论40-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述 宫颈癌的个体化综合化治疗进展50-64
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：684566