miR-1247-5p在原发性肝癌患者血清中的表达及靶向调控Smad2对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响

发布时间：2017-08-17 01:18

  本文关键词：miR-1247-5p在原发性肝癌患者血清中的表达及靶向调控Smad2对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响

  更多相关文章： miR-1247-5p TGF-? Smad2 HepG2 原发性肝癌

【摘要】：目的通过检测临床原发性肝癌患者的血清样本中miR-1247-5p的表达水平,探讨miR-1247-5p在原发性肝癌疾病诊断中的意义。验证miR-1247-5p对Smad2蛋白的靶向调控作用,观察miR-1247-5p对HepG2细胞增殖、迁移能力的影响,探究miR-1247-5p在原发性肝癌发生发展过程中的分子调控机制。方法1.收集宁夏医科大学总医院2014年4月至2015年2月期间临床确诊为原发性肝癌患者的血清样本和同时期的健康体检人群血清样本共82例;Real-time PCR检测,并利用相对定量法计算miR-1247-5p以及mi R-21在两组人群的表达量。2.使用mi RBase,targetscan等软件预测miR-1247-5p可能的靶向调控基因,选定TGF-?信号通路中的Smad2基因作为研究对象。针对Smad2基因3’非翻译区(3’UTR)中与miR-1247-5p有靶向位点的核心作用序列和突变序列设计引物,并用PCR法进行扩增基因并克隆到双荧光素酶报告质粒p MIR-Report载体中。双荧光素酶报告系统验证miR-1247-5p对Smad2靶向作用;Western Blot检测miR-1247-5p对Smad2蛋白表达水平的影响。3.将miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p inhibitor、Smad2过表达载体以及Smad2 RNAi载体转染到HepG2细胞中,以正常培养的HepG2细胞作为空白对照,使用CCK-8试剂盒分别在0h、24h、48h、72h检测细胞增殖情况;细胞划痕实验(wound healing assays)检测0h、24h、48h时的HepG2细胞迁移力变化。结果1.Real-Time PCR数据结果,与健康体检人群相比,原发性肝癌患者血清中mir-21表达量上调3倍(0.01p0.05),mir-1247-5p表达量下调8倍(0.01p0.05)。通过roc曲线分析,mir-1247-5p对hcc的诊断具有一定的诊断价值。2.通过预测smad23'-utr与mir-1247-5p存在两个潜在靶向位点,位于smad2基因序列3390处(site1)和smad2基因序列4420处(site2),分别成功构建两个位点的report-smad23'-utr重组质粒。荧光素酶检测报告结果显示,对位于基因序列3390处的靶向位点,过表达mir-1247-5p可抑制smad2重组载体荧光素酶,抑制mir-1247-5p表达可使smad2重组载体荧光素酶升高(p0.05);对于基因序列4420处靶向位点而言,mir-1247-5p对smad2无明显作用。westernblot实验表明转染mir-1247-5pmimic组中smad2蛋白表达下调(p0.05);而转染mir-1247-5pinhibitor组中,smad2蛋白表达上调(p0.05)。3.cck-8结果所示,smad2过表达组hepg2细胞的增殖率升高,mir-1247-5pmimic组可抑制hepg2细胞的增殖,共转染mir-1247-5pmimic和smad2rnai也抑制了细胞的增殖;而共转染mir-1247-5pmimic和smad2过表达质粒后,细胞的增殖能力有所升高,表明在恢复smad2基因的表达后,可以有效的改变由mir-1247-5p对hepg2细胞所产生的增殖力的影响。划痕实验结果显示与初始0h相比较,在48h时mir-1247-5pmimic可使hepg2细胞迁移力降低,而过表达smad2组使肝癌细胞hepg2迁移力有所增高。结论1.与健康对照人群相比,原发性肝癌患者血清中mir-1247-5p表达有显著性变化,血清中的mir-1247-5p对原发性肝癌的临床诊断具有一定的参考意义,有望成为hcc潜在分子诊断靶标。2.mir-1247-5p通过与smad23'-utr基因序列3390处(site1)位点结合,靶向抑制tgf-?信号通路的关键因子smad2的表达,抑制肝癌细胞hepg2的增殖与迁移。3.研究结果为今后开发针对smad2为治疗靶点的小rna分子药物提供了理论依据。
【关键词】：miR-1247-5p TGF-? Smad2 HepG2 原发性肝癌
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7;R730.43
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-17
• 第一部分 收集临床HCC病人血清样本，检测miR12475p及miR-21表达量17-32
• 材料与方法17-24
• 实验结果24-29
• 讨论29-32
• 第二部分 miR12475p对TGF-?信号通路中Smad2基因靶向调控作用32-50
• 材料与方法32-43
• 实验结果43-47
• 讨论47-50
• 第三部分 miR12475p靶向Smad2对肝癌细胞HepG2的影响50-58
• 材料与方法50-53
• 实验结果53-56
• 讨论56-58
• 结论58-59
• 参考文献59-65
• 综述 microRNA与肝脏常见疾病关系的研究65-76
• 参考文献72-76
• 致谢76-77
• 攻读学位期间发表的的学术论文77-78
• 个人简历78

，

本文编号：686452