拉帕替尼通过影响PKM2表达进而对乳腺癌细胞增殖的影响

发布时间：2017-08-17 06:10

  本文关键词：拉帕替尼通过影响PKM2表达进而对乳腺癌细胞增殖的影响

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【摘要】：目的:探讨乳腺癌细胞M2型丙酮酸激酶(PKM2)与表皮生长因子受体表达的相关性;探讨拉帕替尼作为表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂对PKM2表达的影响;探讨拉帕替尼通过抑制PKM2表达对乳腺癌细胞增殖的影响;探讨拉帕替尼通过抑制乳腺癌细胞PKM2表达对转录因子Stat3表达和磷酸化的影响。方法:1.选取了来自天津医科大学肿瘤医院2013-2014年间乳腺肿瘤科82例乳腺癌病人的癌和癌旁组织,通过免疫组化和组织蛋白Western blot分析乳腺癌的癌组织和癌旁组织中PKM2表达情况。并通过乳腺病理资料的分析研究乳腺癌组织PKM2与EGFR和HER2表达的相关性。2.选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系,通过Western blot分析乳腺癌细胞系中PKM2表达情况,以及EGFR和HER2表达情况。选取高表达EGFR的乳腺癌细胞系MDA-MB-231,利用si RNA对MDA-MB-231进行EGFR基因沉默,通过Western blot检测EGFR基因沉默对MDA-MB-231乳腺癌细胞系PKM2表达的影响。选取高表达HER2的乳腺癌细胞系SK-BR-3,利用si RNA对SK-BR-3进行HER2基因沉默,通过Western blot检测HER2基因沉默对SK-BR-3乳腺癌细胞系中PKM2表达的影响。3.选取高表达EGFR的MDA-MB-231和高表达HER2的SK-BR-3乳腺癌细胞系。通过Western blot和RT-PCR分析拉帕替尼对PKM2表达的影响。选取MDA-MB-231和SK-BR-3两个乳腺癌细胞系,每个细胞系均分成两组:拉帕替尼处理组和DMSO处理组。对每组细胞进行EGF刺激,通过Western blot检测EGF刺激24h和48h对各组细胞PKM2表达和Tyr-105磷酸化的影响;通过RT-PCR检测EGF刺激24h对各组细胞PKM2表达的影响。选取120例经免疫组化分析HER2(+++)或者经FISH检测提示HER2基因扩增的晚期转移性乳腺癌病人。将120乳腺癌病人分成两组:放化疗加拉帕替尼治疗组和单纯放化疗的对照组。通过ELISA法分析这些病人经拉帕替尼治疗后血清中PKM2水平变化。4.选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系,每个细胞系分成三组:拉帕替尼处理组,DMSO处理组,未处理组,用CCK8实验测定每个细胞系中各组细胞的增殖曲线,来观察拉帕替尼对乳腺癌细胞增殖作用的影响。建立PKM2过表达的乳腺癌稳定细胞系,经拉帕替尼处理后通过CCK8实验测定过表达PKM2的乳腺癌细胞系细胞增殖曲线较比对照组有无变化。5.用si RNA对MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系进行PKM2的基因沉默,利用Western blot分析PKM2基因沉默的细胞系中与细胞增殖有关的转录因子Stat3和Tyr-705磷酸化Stat3表达量较比对照组的变化。选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系进行了拉帕替尼处理实验。每个细胞系设置三个组:拉帕替尼处理组、DMSO处理组、未处理组。通过Western blot分析拉帕替尼处理组Stat3和Stat3(Tyr(P)-705)的表达量较比对照组的变化。结果:1.乳腺癌免疫组化分析和乳腺癌组织蛋白Western blot测定,以及对乳腺癌病理资料的分析结果表明:PKM2在乳腺癌组织中表达量比正常癌旁组织有显著增加;乳腺癌组织病理资料通过卡方检验进行分析,结果显示在乳腺癌组织中PKM2与HER2之间存在着正向的相关性,PKM2与EGFR之间存在着正向的相关性;利用si RNA对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的EGFR进行基因沉默,结果显示:MDA-MB-231细胞基因沉默后PKM2表达量较比对照组显著降低;利用si RNA对乳腺癌细胞系SK-BR-3的HER2进行基因沉默,结果显示:SK-BR-3细胞基因沉默后PKM2表达量较比对照组显著降低。2.EGF刺激相同时间时,经拉帕替尼处理的细胞系中PKM2的表达量比DMSO处理组显著降低。在拉帕替尼处理组中,EGF刺激对PKM2表达量的影响不大;而在DMSO处理组,EGF刺激后PKM2表达量较比未经EGF刺激组有显著增高。3.通过ELISA法测定病人血清PKM2的水平,结果说明放化疗加拉帕替尼治疗的乳腺癌患者血清中PKM2的水平比单纯放化疗的乳腺癌患者血清PKM2的水平有显著的降低。4.将经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系通过CCK8实验绘制细胞增殖曲线,结果显示经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞较比DMSO处理组和未处理组增殖显著减慢;PKM2过表达的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌稳定细胞系经拉帕替尼处理后,细胞增殖较比阴性对照组和野生型组明显加快。5.经转染PKM2 siRNA的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系中Stat3和pStat3的表达量较比阴性对照组显著降低;经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系中PKM2的表达量较比对照组有显著的降低;而且经拉帕替尼处理的乳腺癌细胞系Stat3和p Stat3的水平较比对照组也有显著的降低。结论:1.乳腺癌中EGFR与PKM2,HER2与PKM2之间存在着正向的相关性。2.拉帕替尼抑制乳腺癌中PKM2表达。3.拉帕替尼通过影响PKM2表达抑制乳腺癌细胞增殖。4.拉帕替尼通过影响PKM2的表达导致了细胞增殖相关的转录因子Stat3和p Stat3水平的降低从而抑制了细胞增殖。
【关键词】：乳腺癌 丙酮酸激酶 同工酶 拉帕替尼 细胞增殖
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-19
• 研究现状、成果14-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、PKM2在乳腺癌中的表达及与EGFR和HER2表达的相关性19-38
• 1.1 对象和方法19-30
• 1.1.1 实验标本19
• 1.1.2 细胞株19
• 1.1.3 主要试剂19-21
• 1.1.4 主要试剂配制21-22
• 1.1.5 主要仪器22-23
• 1.1.6 方法23-30
• 1.1.7 统计学分析30
• 1.2 结果30-36
• 1.2.1 乳腺癌组织PKM2的表达30-32
• 1.2.2 乳腺癌细胞系PKM2蛋白的表达32-34
• 1.2.3 乳腺癌组织PKM2表达及与EGFR和HER2表达的相关性34-35
• 1.2.4 EGFR基因沉默对乳腺癌细胞系PKM2表达的影响35
• 1.2.5 HER2基因沉默对乳腺癌细胞系PKM2表达的影响35-36
• 1.3 讨论36-37
• 1.4 小结37-38
• 二、拉帕替尼对乳腺癌PKM2表达的影响38-53
• 2.1 对象和方法38-47
• 2.1.1 实验对象38
• 2.1.2 主要试剂38-40
• 2.1.3 细胞株40
• 2.1.4 主要试剂配制40-41
• 2.1.5 引物设计41
• 2.1.6 主要仪器设备41-42
• 2.1.7 方法42-47
• 2.1.8 统计学分析47
• 2.2 结果47-51
• 2.2.1 拉帕替尼和EGF工作浓度的确定47-48
• 2.2.2 拉帕替尼对乳腺癌细胞系PKM2表达的影响48-50
• 2.2.3 拉帕替尼对乳腺癌病人血清中PKM2水平的影响50-51
• 2.3 讨论51-52
• 2.4 小结52-53
• 三、拉帕替尼通过影响PKM2表达对乳腺癌细胞增殖的作用53-64
• 3.1 对象和方法53-60
• 3.1.1 实验对象53
• 3.1.2 主要试剂53
• 3.1.3 细胞株53
• 3.1.4 培养基的制备53-54
• 3.1.5 PCR引物54
• 3.1.6 主要仪器设备54-55
• 3.1.7 方法55-59
• 3.1.8 统计学分析59-60
• 3.2 结果60-62
• 3.2.1 拉帕替尼对乳腺癌细胞增殖的影响60
• 3.2.2 稳定过表达PKM2的MDA-MB-231和SK-BR-3 细胞的Western blot鉴定60
• 3.2.3 过表达PKM2的乳腺癌细胞系在拉帕替尼作用下增殖曲线的测定60-62
• 3.3 讨论62-63
• 3.4 小结63-64
• 四、拉帕替尼影响PKM2表达对Stat3表达和磷酸化的作用64-73
• 4.1 对象和方法64-69
• 4.1.1 主要试剂64-65
• 4.1.2 细胞株65
• 4.1.3 主要试剂配制65-66
• 4.1.4 主要仪器设备66-67
• 4.1.5 方法67-69
• 4.2 结果69-71
• 4.2.1 MDA-MB-231和SK-BR-3 乳腺癌细胞系中下调PKM2蛋白表达后对与细胞增殖有关的信号通路因子Stat3的影响69
• 4.2.2 拉帕替尼通过影响PKM2的表达对与乳腺癌细胞增殖有关的信号通路因子Stat3的影响69-71
• 4.3 讨论71-72
• 4.4 小结72-73
• 结论73-74
• 参考文献74-78
• 发表论文和参加科研情况说明78-79
• 综述 M2型丙酮酸激酶在肿瘤细胞中的多面性79-87
• 综述参考文献83-87
• 致谢87-88
• 个人简历88

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本文编号：687441