RACK1对肝细胞基本功能以及肝细胞氧化应激损伤的影响

发布时间：2017-08-17 09:20

  本文关键词：RACK1对肝细胞基本功能以及肝细胞氧化应激损伤的影响

  更多相关文章： RACK1 条件性基因敲除 活性氧簇 TNF-α诱导的细胞死亡

【摘要】：背景:支架蛋白RACK1(Receptor for activated C kinase 1,活化的C激酶受体1),是WD重复序列家族成员,由7个Trp-Asp(WD40)高度保守的序列组成,分子量约为36KD,因与G蛋白β2亚基同源也被称为GNB2L1(Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1,鸟苷酸结合蛋白亚基beta2样)。RACK1可以依靠其表面形成的丰富的蛋白-大分子相互作用表位与多种胞浆蛋白及细胞亚结构结合,参与多条胞内信号通路以及细胞生命活动的调节。多项研究表明,RACK1在肝细胞癌中存在高表达,通过不同机制促进肝细胞癌发展。然而RACK1在正常肝组织中发挥怎样的作用却尚属未知。本研究主要利用RACK1在肝细胞内条件性基因敲除小鼠,对RACK1在正常肝细胞中发挥怎样的作用进行研究;进一步对RACK1在氧化应激相关的肝损伤动物模型以及细胞模型中发挥的作用进行探讨。目的:探讨RACK1在肝细胞内缺失对小鼠存活率的影响;探讨RACK1在肝细胞内缺失对肝功能及肝组织代谢的影响;探讨RACK1在肝细胞内缺失对肝细胞氧化应激损伤的影响;探讨RACK1在肝癌细胞应对氧化应激损伤中的作用和机制。方法:我们利用课题组已经建立的RACK1肝细胞内特异性敲除小鼠模型进行相关课题的研究。基因型为RACK1 loxp+/+,Alb+/-的称为KO小鼠;相应的,基因型为RACK1 loxp+/+,Alb-/-的小鼠为对照小鼠(WT),对同窝同性别的WT和KO小鼠进行体重检测、鼠尾血的采集,探讨了RACK1在肝实质细胞内的缺失对小鼠生存率及肝功能的影响;通过对小鼠肝组织的免疫组化检测及油红O检测,探讨了RACK1在肝细胞增殖及代谢中的作用;利用肝脏缺血再灌注的病理模型,观察RACK1在肝细胞氧化应激损伤中的作用;利用原代肝细胞分离方法从体外方面验证了RACK1在肝细胞中对TNF-α诱导的细胞死亡的作用;课题组其他成员利用免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法发现了RACK1潜在结合蛋白氧化还原酶CBR1,我们利用免疫共沉淀的方法验其相互作用;利用流式检测方法验证了RACK1与CBR1在肝细胞系细胞氧化应激损伤中的作用,并对机制进行探讨。结果:通过对WT和KO小鼠中的多项平行实验的观察,未发现RACK1缺失对小鼠的生存率及体重有显著性影响;发现RACK1缺失能够造成一定程度的肝细胞本底增殖,发现RACK1缺失导致脂肪堆积并一定程度的加重肝缺血再灌注损伤。在分离的WT和KO小鼠的原代肝细胞中,发现RACK1的缺失显著增强了TNF-α和CHX诱导的肝细胞死亡。在肝癌细胞系中,发现敲低RACK1会促进细胞ROS(Reactive Oxygen Species,活性氧簇)产生,发现RACK1能够促进CBR1表达上调,进而发现RACK1能够通过CBR1抑制肝癌细胞ROS产生。结论:RACK1在正常肝细胞中的缺失对肝组织代谢造成一定影响并一定程度的增加肝缺血再灌注损伤;在肝癌细胞系中,RACK1通过CBR1抑制ROS产生,拮抗TNF-α和过氧化氢诱导的细胞死亡。
【关键词】：RACK1 条件性基因敲除 活性氧簇 TNF-α诱导的细胞死亡
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-13
• 前言13-15
• 第一章 RACK1基因在肝细胞内的缺失对小鼠生长发育的影响15-29
• 第一节 RACK1在肝细胞内特异性缺失对小鼠生长发育及肝功能影响17-21
• 1 材料和方法17-18
• 1.1 实验动物17
• 1.2 主要的材料和仪器17
• 1.3 小鼠出生率统计17
• 1.4 不同周龄KO、WT小鼠体重统计17
• 1.5 鼠尾静脉采血17-18
• 1.6 数据统计学分析18
• 2 结果18-21
• 2.1 RACK1在肝细胞内特异性缺失对小鼠出生率的影响18
• 2.2 RACK1在肝细胞内特异性缺失对小鼠体重的影响18-20
• 2.3 RACK1在肝细胞内特异性缺失对小鼠肝功能的影响20-21
• 第二节 RACK1在肝细胞内特异性缺失对肝细胞增殖及代谢的影响21-27
• 1 材料和方法21-23
• 1.1 实验动物21
• 1.2 主要试剂21
• 1.3 主要仪器设备21
• 1.4 小鼠肝组织的摘取及组织切片的制备21
• 1.5 小鼠肝组织的免疫组化21-23
• 1.6 油红O染色23
• 2 结果23-25
• 2.1 RACK1在肝细胞内特异性缺失对肝组织表型的影响23-24
• 2.2 RACK1基因在肝细胞内特异性缺失对肝细胞增殖的影响24
• 2.3 RACK1基因在肝实质细胞内的缺失对肝组织内的脂肪代谢影响24-25
• 3 讨论25-27
• 本章小结27-29
• 第二章 RACK1在肝细胞内的缺失对肝细胞应对氧化应激的影响29-43
• 第一节 RACK1在肝细胞内的缺失对小鼠肝组织缺血再灌注的影响31-35
• 1 材料和方法31-32
• 1.1 实验动物31
• 1.2 主要的材料和仪器31
• 1.3 主要试剂31
• 1.4 小鼠肝缺血再灌注模型建立31-32
• 1.5 小鼠转氨酶检测32
• 1.6 TUNEL免疫组化32
• 2 结果32-35
• 2.1 小鼠肝缺血再灌注后RACK1对转氨酶的影响32-34
• 2.2 RACK1在肝细胞内的特异性缺失对IR术后肝细胞凋亡的影响34-35
• 第二节 RACK1对由TNF-Α 诱导的小鼠肝细胞氧化应激的影响35-41
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 实验动物35
• 1.2 细胞株35
• 1.3 主要试剂35-36
• 1.4 主要的仪器设备36
• 1.5 主要试剂配制36
• 1.6 小鼠肝实质细胞分离方法36-37
• 1.7 Hoechst染色37
• 1.8 慢病毒感染细胞后凋亡检测37
• 2 结果37-39
• 2.1 RACK1对由TNF-α加CHX所诱导的小鼠原代肝细胞的凋亡的影响37-38
• 2.2 RACK1基因在BNLCL.2 细胞内敲低后对TNF-α诱导的细胞凋亡检测38-39
• 3 讨论39-41
• 本章小结41-43
• 第三章 RACK1通过抑制ROS产生，拮抗氧化应激损伤43-55
• 1 材料和方法43-46
• 1.1 细胞株43
• 1.2 主要试剂43
• 1.3 主要仪器设备43-44
• 1.4 常用试剂配备44
• 1.5 细胞转染44
• 1.6 蛋白内源性结合检测44-45
• 1.7 ROS测定45
• 1.8 蛋白免疫印迹45-46
• 1.9 细胞凋亡的流式检测46
• 2 结果46-52
• 2.1 肝癌细胞内敲低RACK1对细胞凋亡的影响46-47
• 2.2 肝癌细胞内敲低RACK1基因对ROS的影响47-48
• 2.3 肝癌细胞内敲低CBR1对细胞凋亡的影响48-50
• 2.4 RACK1与CBR1存在相互作用50
• 2.5 细胞的RACK1蛋白与CBR1蛋白表达量的相关性检测50-51
• 2.6 CBR1 在肝癌细胞20#敲低克隆中对凋亡的逆转51-52
• 3 讨论52-53
• 本章小结53-55
• 全文总结55-57
• 参考文献57-59
• 综述59-67
• 参考文献65-67
• 攻读学位期间所投出的文章及参加的会议67-68
• 致谢68-69

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