PIM1激酶线性泛素化修饰及其功能研究

发布时间：2017-08-17 18:03

  本文关键词：PIM1激酶线性泛素化修饰及其功能研究

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【摘要】：蛋白激酶PIM是丝/苏氨酸激酶家族的重要组成部分,包括PIM1、PIM2、PIM3三个成员,该家族蛋白氨基酸序列同源性很高,功能相近,但其分布具有组织特异性。PIM基因发挥多方面的生物学功能,包括肿瘤的发生发展、细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢、细胞自噬、胚胎干细胞干性维持等多个方面。目前发现PIM家族在多种恶性肿瘤中高表达并在肿瘤形成和转移中发挥重要功能,已成为抗肿瘤药物的新靶点。在PIM蛋白家族的三个成员中,尤以PIM1的功能研究最为广泛,该分子首次被发现时定义为鼠的白血病前病毒插入位点,它编码34 KD和44 KD两个亚型的蛋白。PIM1蛋白是一个刺激反应性蛋白,其表达水平受多种因素诱导,例如:GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、EPO、PMA、干扰素γ等均可诱导其高表达。PIM1蛋白通过磷酸化不同的底物蛋白从而参与肿瘤发生、细胞周期、细胞凋亡等多方面功能。在肿瘤发生发展方面,重要的信号通路Jak-STAT和NF-?B通过促进PIM1基因转录,从而上调PIM1的表达水平,另一方面,高表达的PIM1蛋白又能够负反馈调节这两条信号通路抑制其持续激活。细胞周期方面,PIM1可在不同时期通过磷酸化检查点蛋白Cdc25A或者Cdc25C影响细胞周期的进程,促进细胞周期G1/S或G2/M检查点的转换;另外PIM1还可通过磷酸化激酶CDK的抑制分子p27Kip1,促进p27降解,进而加速细胞周期进程。细胞凋亡方面,PIM1通过磷酸化促凋亡蛋白BAD引发BAD蛋白的降解,从而抑制细胞凋亡并提高细胞存活能力。美国圣地亚哥大学Mark Sussman等研究证明,PIM1可以通过磷酸化线粒体膜蛋白Drp1从而抑制其线粒体转位,保护心肌细胞免受死亡,PIM1已成为缺血性心肌损伤治疗的新靶点。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,它参与调控细胞的周期进程、基因转录、DNA修复、信号传导等多个方面。已知的泛素化修饰包括单泛素化和多泛素化两种类型,关于它们的生物学功能目前已被广泛研究。近年来国际上报导了一种全新的泛素化修饰形式—线性泛素化,它是将泛素以首尾相连的方式共价结合到底物蛋白分子的赖氨酸残基上,完成对底物蛋白的修饰。2009年日本科学家Kazuhiro Iwai首次报道NF-?B信号通路中IKK复合物的成员NEMO能够发生线性泛素化修饰,这种修饰会改变NEMO自身构象,增强IKK复合体的稳定性,进而促进NF-?B信号通路的激活。NEMO是已知能够发生线性泛素化修饰的蛋白分子,其分子结构特点是含有一个亲和线性泛素化链的UBAN结构域,该结构域能够招募线性泛素化链,从而使NEMO分子发生聚合。本项研究以线性泛素化修饰作为切入点,希望发现新的线性泛素化底物分子,并研究其生物学功能。我们利用UBAN结构域的特殊氨基酸序列进行生物信息学分析,筛选到若干潜在的能够发生线性泛素化修饰的蛋白分子,其中PIM1蛋白是底物候选分子之一。近年来关于PIM1功能研究的报道很多,其发挥生物学作用依赖于丝/苏氨酸激酶活性,科学家们一直致力于研究激酶PIM1的小分子抑制剂作为抗肿瘤药物,因此PIM1激酶活性的调控成为研究重点。文献报道PIM1激酶活性主要受其表达水平和稳定性的调控,它通常是以泛素—蛋白酶体途径降解从而影响稳定性,那么PIM1蛋白能否通过线性泛素化修饰机制调控其激酶活性有待于深入研究。本项研究我们通过泛素化实验验证PIM1蛋白分子能够发生线性泛素化修饰,并进一步探讨了这种特殊翻译后修饰的生物学功能。首先我们通过PCR技术在体外扩增获得PIM1基因片段,经过Hind III和Eco R I两种限制性核酸内切酶酶切得到具有相同酶切位点的PIM1基因片段和pc DNA 3.0载体片段,利用T4 DNA连接酶将PIM1基因片段插入载体中,构建表达良好的Flag-PIM1质粒,为后续验证实验奠定良好基础。在HEK293T细胞中过表达线性泛素化E3酶HOIP、HOIL-1L、SHARPIN及Flag-PIM1质粒,通过免疫沉淀(IP)方法富集PIM1蛋白,利用线性泛素化抗体免疫印迹发现过表达E3酶后,PIM1发生明显的线性泛素化修饰现象,而阴性对照组不能观察到该现象,说明PIM1蛋白在过表达体系下能够发生线性泛素化修饰。为了进一步确认这一现象并鉴定线性泛素化修饰的赖氨酸残基位点,我们在HEK293T细胞中过表达PIM1及线性泛素化E3酶和泛素Ubiquitin,通过IP手段富集线性泛素化修饰的PIM1蛋白分子,经过蛋白洗脱,超滤等过程,制备PIM1蛋白样品并进行质谱鉴定。质谱分析结果显示PIM1蛋白酶解的肽段中含有氨基酸序列为GGMQIF(G-甘氨酸,M-甲硫氨酸,Q-谷氨酰胺,I-异亮氨酸,F-苯丙氨酸)的多肽片段,此序列为线性泛素化链的特征序列,证明了PIM1线性泛素化修饰的存在。此外,质谱分析结果提示K67和K169赖氨酸位点可能作为线性泛素化修饰的位点,因此进一步研究拟构建这两个位点的突变体,通过泛素化实验验证它们是否为线性泛素化修饰位点。PIM1蛋白在细胞内发挥的重要生物学功能依赖于其对众多底物蛋白的磷酸化修饰,因此我们利用体外激酶实验研究PIM1线性泛素化修饰是否影响了它的激酶活性。在激酶反应体系中,加入纯化的组蛋白H3作为PIM1激酶底物、能量ATP、激酶PIM1,以激酶Aurora磷酸化组蛋白H3作为实验体系的阳性对照。体外激酶实验结果显示,与未修饰PIM1对照组相比,线性泛素化修饰PIM1导致的组蛋白H3磷酸化水平明显降低,说明PIM1线性泛素化修饰能够抑制其激酶活性。综上,我们发现了PIM1蛋白一种新的翻译后修饰方式—线性泛素化修饰,并利用质谱方法鉴定了潜在的线性泛素化修饰赖氨酸位点,进一步体外激酶实验证明PIM1线性泛素化修饰能够明显抑制其丝/苏氨酸激酶活性。本项研究不仅发现了PIM1蛋白的线性泛素化修饰现象,而且证明该修饰能够影响其发挥功能所需的激酶活性,这将为深入探讨PIM1蛋白的生物学功能提供重要依据,并为基于PIM1抗肿瘤治疗研究提供新的思路和策略。
【关键词】：PIM1 线性泛素化 激酶
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-17
• 实验材料与方法17-28
• 1. 材料与来源17-19
• 1.1 菌株与质粒17
• 1.2 主要试剂17-18
• 1.2.1 克隆构建相关试剂17
• 1.2.2 免疫印记与免疫沉淀相关试剂17
• 1.2.3 细胞培养所需试剂17-18
• 1.2.4 实验所需抗体18
• 1.3 实验仪器18-19
• 1.4 主要试剂配方19
• 2.实验方法19-28
• 2.1 筛选PIM1分子19
• 2.2 Flag-PIM1质粒构建19-25
• 2.2.1 GFP-PIM1质粒测序19-20
• 2.2.2 构建Flag-PIM1质粒20-24
• 2.2.3 Flag-PIM1阳性克隆鉴定与测序24-25
• 2.3 细胞培养和转染25
• 2.4 免疫共沉淀实验25-26
• 2.5 质谱鉴定26
• 2.6 体外激酶实验26-27
• 2.7 统计学处理27-28
• 实验结果28-44
• 1. 线性泛素化底物的筛选28
• 2. 构建Flag-PIM1质粒28-31
• 2.1 Flag-PIM1克隆的构建28-30
• 2.2 检测PIM1基因表达30-31
• 3. PIM1线性泛素化修饰的鉴定31-36
• 3.1 PIM1与线性泛素化E3酶存在相互作用31
• 3.2 PIM1是线性泛素化底物31-34
• 3.3 PIM1线性泛素化修饰依赖于HOIP的E3酶活性34-35
• 3.4 OTULIN导致PIM1发生去线性泛素化35-36
• 4. 质谱方法鉴定PIM1线性泛素化修饰及位点36-42
• 5. PIM1线性泛素化修饰抑制其激酶活性42-44
• 讨论44-46
• 总结46-47
• 参考文献47-52
• 文献综述52-58
• 参考文献54-58
• 个人简历58-59
• 致谢59-60

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本文编号：690347