急性B淋巴细胞白血病差异miRNA综合调控网络的生物信息学分析

发布时间：2017-08-17 17:08

  本文关键词：急性B淋巴细胞白血病差异miRNA综合调控网络的生物信息学分析

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【摘要】：急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)是种由B淋巴细胞在血液或骨髓中异常增殖引起的恶性血液疾病,是急性淋巴细胞白血病最常见的类型；主要发生在儿童,在成人中相对少见。近年来,基于危险度分层指导的治疗,有85%B-ALL的儿童治愈,但有少部分未评为高风险的儿童治疗后仍然复发；而且与儿童相比,成人B-ALL的生存率明显低于40%。随着全基因组遗传分析技术等技术的发展,发现B-ALL发病机制主要是染色体异常及基因表达异常,其中染色体异常包括染色体数目异常(如超二倍体、近单倍体和低亚二倍体等)和染色体结构异常(如染色体异位t(9;22)(q34;q11.2) BCRABL1、t(12;21)(p13;q22) ETV6-RUNX1、t(1;19)(q23;p13) TCF3-PBX1和MLL基因重排；ATM.IKZF1和CDKN2A基因丢失等)；基因表达异常包括BCL2、 FLT3和HOXA等基因的异常表达。这些基因的功能及参与的生物学过程很多已被阐明,但在恶性转换和多步发病中的调控机制还是知道得很少。至今,B-ALL的发病机制仍然未完全清楚。对发病机制的深入研究将有利于发展更先进的诊断及治疗方法。基因表达的调控对于所有细胞稳定性和维持性都是很必须的,而基因表达的调节异常是和多种恶性肿瘤的发病机制相关的。造血细胞的增长、分化和成熟的调控是个涉及多因素、多水平的复杂调控,包括了基因调控。它们以不同的调节方式共同调控造血细胞增殖、分化、迁移、归巢和凋亡的全过程,以达到调控造血,维持正常造血平衡目的。造血干细胞、祖细胞增殖分化的各个环节都受到复杂的多基因调控。目前,大家公认的急性B淋巴细胞白血病是由多基因参与,并形成复杂的网络共同作用的结果,其中微小、RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和转录因子(transcription factor, TF)对基因表达的调控,是B-ALL复杂网络中的重要组成部分。基因芯片是随着人类基因组计划快速发展起来的。它是具有高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化等特点的分子生物学高新技术。随着芯片技术的越来越发展,不同种类的芯片也应运而生。其中miRNA芯片的商业化发展以及越来越广泛的应用,使得miRNA表达芯片已经作为一种高通量,特异性、高敏感性的用来研究miRNA有力的工具,也是逐渐成为研究miRNA表达的最普遍和有效的检测方法。随着芯片数据的高速增长,需要对这些数据进行收集、存储和管理,目前有GEO (Gene Expression Omnibus)、SMD (Stanford Microarray Database)、 ArrayEpress等与基因表达数据相关的公共数据库：而且这些公共数据库提供芯片数据的查询、检索以及下载。芯片数据的增长带动了芯片数据分析软件的发展,目前芯片数据分析软件有公开免费的和商业化的,芯片数据分析软件的应用为整个数据分析提供了很重要的帮助。随着近些年来,大家对于miRNA的越来越深入的分析研究,促使了与miRNA相关的生物信息学得以迅速发展,形成很多与miRNA相关的数据库和软件,如有miRNA与靶基因的数据库、miRNA与非编码RNA的相互作用数据库和miRNA与转录因子调控关系的数据库。这些与miRNA相关的生物信息学工具的发展,为我们此次研究构建以miRNA为中心的综合调控网络的生物信息学分析提供可能。因此,此次研究,我们是以芯片数据分析得到的差异niRNA为切入点,运用生物信息学方法综合分析差异miRNA,用分析得到生物数据来构建以差异miRNA为中心的综合调控网络,从而以系统水平去研究急性B淋巴细胞白血病的发病机理,为B-ALL的诊断和治疗提供新的生物靶标具有非常重要的理论意义和迫切的现实意义。首先我们从NCBI (National Center for Biotechnology Information)的公共数据库GEO中,下载了急性B淋巴细胞白血病的miRNA芯片数据GSE51908。以这GSE51908数据集为分析材料,利用Qlucore Omics Explorer 3.0软件对GSE51908数据集进行差异表达niRNA的分析。接着对这些差异miRNAs进行了差异miRNAs与靶基因、长链非编码RNA和转录因子的调控关系的生物信息学分析。对差异miRNA进行靶基因分析,我们采用的是含有多个的预测软件并且整合紫外交联免疫共沉淀测序(corsslinking and immunoprecipitation sequencing, CLIP-Seq)及mRNA降解组测序(degradome sequencing, Degradome-Seq)数据来支持的miRNA靶标的数据库StarBase和专门收录实验证明且整合其他类似数据库的验证数据库MiRNATarBas的组合分析,对这些差异miRNAs靶基因进行准确全面的分析,总共获得了631个miRNAs和靶基因的调控对。接着差异niRNA与长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)调控关系的分析,是利用整合108组CLIP-Seq的高通量测序实验数据能系统集中的鉴定miRNA与Target相互作用关系的StarBase v2.0软件,得到了161个差异miRNAs与长链非编码RNA的调控关系数据。然后我们采用了整理染色质免疫共沉淀与二代测序(chromatin immunoprecipition with next-generation DNA sequencing, ChIP-seq)的高通量测序数据检测出数以万计的转录因子结合位点(transcripition factor binding sites, TFBS)从而鉴定出转录因子(transcripition factor, TF)与miRNA调控关系的ChIPBase数据库,进行了差异miRNAs与TF的调控关系的分析,得到了301个差异miRNAs与转录因子的调控对。最后将这些差异miRNAs综合多种生物信息学工具分析得到的差异miRNA与靶基因、差异miRNA与长链非编码RNA以及差异miRNA与转录因子的调控数据：用网络可视化的cytoscape软件来构建以差异miRNA为中心的综合调控网络。接着对综合调控网络的进一步分析找出核心靶标；另外对一些差异miRNA调控的靶基因进行了生物学信息注释数据库(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID)中的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析；再对核心靶标进行文献挖掘等分析,继而找出综合调控网络中的核心差异miRNA 。通过上述的多种生物信息学工具的综合分析,我们在急性B淋巴细胞白血病的GSE51908数据集中一共筛选出15个差异miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,8个miRNAs表达下调。再对综合调控网络进行核心靶标分析,在综合调控网络中找到20个核心靶标,其中只有1个是长链非编码RNA XIST,其余的19个全部都是转录因子,没有核心靶标是属于靶基因的。在核心靶标中PU.1转录因子,据文献报道PU.1转录因子对造血干细胞谱系发育为淋巴系的选择过程中起着重要的作用；其表达缺失可导致造血干细胞向淋巴系分化障碍；而且其表达紊乱可使血细胞发育受阻并引发人类急性白血病。这些PU.1研究结果,说明我们分析认为核心靶标在B-ALL的发生发展起到重要作用是相符合的。从综合调控网络图明显得知,Hsa-miR-29a、hsa-miR-130a和hsa-miR-181c调控大量的长链非编码RNA,包括核心靶标lncR XIST。对核心靶标XIST文献分析显示,XIST缺失会导致X染色体再激活(X-reactivation),诱导许多X连锁基因(X-linked gene)异常表达,其包括了低表达的造血调控因子如FLT3基因。另外发现,转录因子阴阳子-1 (Ying yang-1, YY1)在XIST序列上有特异的结合位点,促使X染色体失活；hsa-miR-29a抑制YY1表达,而且高表达YY1和NFκB能解除hsa-miR-29a的抑制。因此我们认为：hsa-miR-29a通过与NFκB、 YY1相互作用负调控XIST对X染色体失活的调控,从而影响X-linked基因异常表达,参与急性B淋巴细胞白血病发生发展。据综合调控网络可知,Hsa-miR-181a-2、hsa-miR-181b-2和hsa-miR-663调控大量的转录因子,包括CDX2、YY1等。网络分析可知,尾部相关的同源盒基因CDX2 (caudal- related homeobox transcription fact 2, CDX2)连接到11个差异miRNA,是最为核心靶标。而且发现核心靶标CDX2：转录因子CDX2调控hsa-miR-181,而CDX2基因作为hsa-miR-181靶基因,故hsa-miR-181与CDX2呈现反馈调控方式。对CDX2文献挖掘,发现CDX2与急性白血病预后相关,而且与Wnt通路相关。另外还发现,NLK基因是hsa-miR-181靶基因而且还是Wnt通路负调控因子。所以我们认为,hsa-miR-181通过与CDX2的反馈调控NLK基因对Wnt通路调控,进而影响到B细胞增殖和凋亡。通过综合调控网络可明显看出,hsa-miR-126和hsa-miR-486-3p调控大量的靶基因。由于核心靶标没有基因,故对hsa-miR-126和hsa-miR-486-3p靶基因进行通路分析,结果显示hsa-miR-126靶基因富集到3条通路,其中Wnt信号通路P值小于0.05符合统计学意义,富集到Wnt通路的4个基因包括DVL3基因在内。文献发现,DVL3基因转录翻译成为Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白是Wnt通路重要蛋白,能将Wnt信号从受体传递到下游效应分子上。另外CDX2调控hsa-miR-126表达。故我们认为：hsa-miR-126通过DVL3基因负调控Wnt通路,而且hsa-miR-181可通过与CDX2调控hsa-miR-126对Wnt通路调控,从而影响B细胞增殖和凋亡。通过上述综合的分析,我们得出了的结论是：hsa-miR-29a通过YY1负调控XIST对X染色体失活的调控,参与B-ALL发生发展。hsa-miR-181通过与CDX2调控NLK基因和hsa-miR-126,从而调控Wnt通路,影响B细胞增殖和凋亡。hsa-miR-29a、hsa-miR-126和hsa-miR-181家族是急性B淋巴细胞白血病的核心差异miRNA,在急性B淋巴细胞白血病的发生发展过程起到重要的作用；所以它们可能作为急性B淋巴细胞白血病潜在的治疗靶点和诊断指标。
【关键词】：急性B淋巴细胞白血病 差异表达miRNA 生物信息学 综合调控网络 CDX2XIST
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 绪论15-30
• 1.1 急性B淋巴细胞白血病15-19
• 1.2 芯片的发展及应用19-22
• 1.3 miRNA相关的生物信息学的发展22-30
• 第二章 差异表达miRNA的生物信息学分析30-49
• 2.1 材料和方法30-37
• 2.2 结果37-49
• 第三章 差异miRNA综合调控网络的构建与分析49-60
• 3.1 材料与方法49-52
• 3.2 结果52-60
• 讨论60-64
• 结论64-65
• 参考文献65-71
• 附录71-74
• 成果74-75
• 致谢75-76

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本文编号：690140