甲硫哒嗪对人结肠癌干细胞的作用研究

发布时间：2017-08-19 17:37

  本文关键词：甲硫哒嗪对人结肠癌干细胞的作用研究

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【摘要】：肿瘤干细胞是肿瘤中数量较少但生命力很强的细胞，它抵抗化疗和放疗，不易被定位,还可分化成新的肿瘤细胞,导致癌症复发。因此，杀伤肿瘤干细胞已成为癌症治疗的重点和难点。 结肠癌在西方国家占肿瘤死亡率的第二位，我国结肠癌发病人数也呈逐年上升趋势。结肠癌的病变位置隐蔽，早期症状不明显，容易被患者忽略，且预后多复发，复发后多产生耐药。因此，寻找有效的治疗方法十分重要。肿瘤干细胞的发现为结肠癌的治疗开辟了新的道路。 甲硫哒嗪是一种吩噻嗪类药物，最早以抗精神分裂作用为人熟知，近年来文献报道，其亦可作为抗肿瘤药物，作为多巴胺受体拮抗剂，抑制D2家族DR受体，阻断DR信号通路，产生抗血癌肿瘤干细胞的作用，具有安全性高，毒副作用小等优点。 另有文献报道，甲硫哒嗪通过靶向抑制血癌干细胞、胃癌干细胞及乳腺癌干细胞等多种肿瘤细胞的增殖，诱导凋亡，发挥抗肿瘤的作用，但对于结肠癌干细胞的研究甚少。 本研究利用免疫磁珠法从结肠癌肿瘤细胞HCT116中筛选出表面标记为EpCAM+CD44+的结肠癌干细胞，并通过诱导分化、单细胞克隆、细胞免疫化学以及干细胞特异性基因表达的检测等方法进行鉴定。利用CCK8法检测甲硫哒嗪对结肠癌干细胞增殖的影响。通过AO/EB荧光双染法、线粒体膜电位法、Annexin-V-FITC双染法及流式分析等方法评价甲硫哒嗪对结肠癌干细胞的影响。结果显示，筛选所得的EpCAM+CD44+HCT116在无血清培养基中逐渐形成微球，悬浮生长，，经含血清培养液诱导后，细胞微球呈现贴壁生长状态。甲硫哒嗪可抑制结肠癌干细胞的增殖，并存在剂量依赖性，在浓度1μmol/L时，有轻微的促进增殖作用。在甲硫哒嗪的作用下，随着浓度的增加，结肠癌干细胞成球能力逐渐下降；AO/EB结果提示甲硫哒嗪的浓度越高，细胞凋亡程度越大；Annexin-V-FITC双染法提示，凋亡早期细胞比例随着甲硫哒嗪浓度的增加也随之增大；JC-1结果显示线粒体膜电位降低，并且甲硫哒嗪的浓度越高，凋亡细胞所占比例越大；Q-PCR检测结果提示促凋亡基因Bax表达上调，抗凋亡基因Bcl-2表达下调；Western Blot结果提示甲硫哒嗪引起的凋亡是通过Caspase途径实现的，且Caspase3的表达随着药物浓度的增加而发生变化。 综上所述，甲硫哒嗪可抑制结肠癌干细胞的增殖，诱导结肠癌干细胞凋亡；本研究为靶向作用肿瘤干细胞的药物开发奠定了实验依据，为结肠癌治疗的研究奠定了实验基础。
【关键词】：甲硫哒嗪 肿瘤干细胞 结肠癌 凋亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文对照12-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 肿瘤干细胞13
• 1.1.1 肿瘤干细胞13
• 1.1.2 肿瘤干细胞的生物学特性13
• 1.2 肿瘤干细胞的分离与鉴定13-15
• 1.2.1 流式细胞分选法（FACS）14
• 1.2.2 磁性细胞分选法（MACS）14
• 1.2.3 侧群细胞分选法14-15
• 1.2.4 肿瘤干细胞的鉴定方法15
• 1.3 结肠癌干细胞及其标记物15-18
• 1.3.1 CD13316
• 1.3.2 CD4416-17
• 1.3.3 EpCAM17
• 1.3.4 Nanog17-18
• 1.3.5 CLDN-618
• 1.4 甲硫哒嗪（Thioridazine）18-20
• 1.4.1 甲硫哒嗪可抑制肿瘤细胞的增殖18-19
• 1.4.2 甲硫哒嗪可促进肿瘤干细胞分化19
• 1.4.3 甲硫哒嗪可诱导肿瘤细胞的凋亡19-20
• 1.5 实验立题依据20-21
• 第2章 材料与试剂21-27
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 仪器21
• 2.1.2 试剂21-23
• 2.1.3 细胞株23
• 2.1.4 PCR 所用引物23
• 2.2 主要试剂配制23-27
• 2.2.1 PBS 配制23
• 2.2.2 0.25%胰酶-EDTA 混合液配制（10×）23-24
• 2.2.3 RPMI 1640 培养液配制24
• 2.2.4 DMEM/F12 肿瘤干细胞培养液配制24
• 2.2.5 磁珠分选用 Buffer1 配制24
• 2.2.6 磁珠分选用 Buffer2 配制24-25
• 2.2.7 磁珠分选用 Buffer3 配制25
• 2.2.8 磁珠分选用 Dnase I 配制25
• 2.2.9 药物溶液的配制25
• 2.2.10 Western Blot 分析用 30%聚丙酰胺溶液配制25
• 2.2.11 Western Blot 分析用 10%SDS 溶液25
• 2.2.12 Western Blot 分析用 10%过硫酸铵（APS）溶液25-26
• 2.2.13 Western Blot 分析用 SDS-PAGE 电泳缓冲液（5×）26
• 2.2.14 Western Blot 分析用转膜液（10×）26
• 2.2.15 Western Blot 分析用 TBS 缓冲液（10×）26
• 2.2.16 5%封闭液26
• 2.2.17 Western Blot 制胶浓度26
• 2.2.18 吖啶橙（AO）26
• 2.2.19 溴化乙锭（EB）26-27
• 第3章 实验方法27-36
• 3.1 结肠癌干细胞的分选、培养及鉴定27-32
• 3.1.1 免疫磁珠法筛选 EpCAM~+CD44~+结肠癌干细胞27-28
• 3.1.2 结肠癌干细胞培养28-29
• 3.1.3 EpCAM~+CD44~+结肠癌干细胞的鉴定29-32
• 3.2 甲硫哒嗪对结肠癌干细胞增殖的影响32-33
• 3.3 甲硫哒嗪对结肠癌干细胞凋亡的影响33-35
• 3.3.1 细胞形态观察33
• 3.3.2 吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）双染33
• 3.3.3 Annexin V-FITC-PI 双染色法检测细胞早期凋亡33
• 3.3.4 细胞凋亡线粒体膜电位检测（JC-1）33-34
• 3.3.5 Bax 和 Bcl-2 的 Q-PCR 检测34
• 3.3.6 Western Blot 检测 caspase3 蛋白的表达34-35
• 3.4 数据分析35-36
• 第4章 实验结果36-43
• 4.1 结肠癌干细胞的分选、培养及鉴定36-39
• 4.1.1 EpCAM~+CD44~+HCT116 细胞的筛选36
• 4.1.2 EpCAM~+CD44~+HCT116 细胞的培养36
• 4.1.3 EpCAM~+CD44~+HCT116 细胞的鉴定36-39
• 4.2 甲硫哒嗪对结肠癌干细胞增殖的影响39
• 4.3 甲硫哒嗪对结肠癌干细胞凋亡的影响39-43
• 4.3.1 药物作用后的细胞形态变化39
• 4.3.2 吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）双染39-40
• 4.3.3 Annexin V-FITC-PI 双染色法检测细胞早期凋亡40-41
• 4.3.4 细胞凋亡线粒体膜电位检测（JC-1）41
• 4.3.5 Bax 和 Bcl-2 的 Q-PCR 检测41-42
• 4.3.6 Western Blot 分析42-43
• 第5章 讨论43-45
• 第6章 结论45-46
• 参考文献46-49
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果49-50
• 致谢50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Caterina Fanali;Donatella Lucchetti;Marisa Farina;Maddalena Corbi;Valerio Cufino;Achille Cittadini;Alessandro Sgambato;;Cancer stem cells in colorectal cancer from pathogenesis to therapy: Controversies and perspectives[J];World Journal of Gastroenterology;2014年04期

本文编号：702059