pH响应性纳米胶囊递送miRNA治疗食管癌作用的研究

发布时间：2017-08-19 18:23

  本文关键词：pH响应性纳米胶囊递送miRNA治疗食管癌作用的研究

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【摘要】：食管癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,位于世界癌症死亡率第六位。食管癌的形成是多因素多步骤累积的综合过程,早期症状不明显,并且缺乏有效的治疗措施,多数患者就诊时已处于晚期,预后效果比较差。目前食管鳞癌的临床治疗目前主要以手术切除和药物化疗为主,五年生存率低于15%,主要原因归结于食管癌的高复发性和有效治疗药物的缺乏。因此,研发新型低毒、高效、可以特异性靶向肿瘤的药物成为食管癌研究领域的热点之一。随着纳米技术的迅速发展及在肿瘤治疗领域中的应用,借助纳米技术开发新型抗食管癌纳米药物逐渐成为药物研究的新趋势,对于食管癌的发生率和死亡率的降低有着重大意义。MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,长度为20~25个核苷酸。MiRNA可以与信使RNA的3’端非编码区结合,从而调节基因的表达水平,是真核生物中最重要的基因调控因子之一。其中,miR-203是一类来源于上皮基底细胞的miRNA,由于它在食管癌的发生、发展及转移过程中起着重要的作用,已逐渐成为食管癌鉴定、诊断与治疗的新型靶标分子。研究表明,mi R-203通过抑制Ran,E2F1、LASP-1等靶蛋白的表达来抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,从而发挥抑制癌症的作用。目前基于miRNA的干扰药物是新药研发的热点之一,但由于mi RNA本身穿膜能力较差,并且在体内环境中易降解,因此开发miRNA抗癌药物的关键在于递送载体的选择。在本研究中,我们利用O-羧甲基壳聚糖和细胞穿膜肽TAT为载体材料,通过自组装法,构建包载miR-203的pH响应性纳米胶囊,实现miR-203向食管癌细胞的高效纳米递送系统。然后对纳米胶囊的形态结构、包封率、稳定性、pH响应功能、药物释放效率等一系列参数进行表征分析和优化,最终筛选并制备出了尺寸均匀、稳定性强、具有优良载药性能的纳米药物。一系列细胞体外实验结果显示,pH响应型纳米胶囊可以高效地将miR-203递送至食管癌细胞内并从溶酶体逃逸,快速释放到胞质内发挥作用,并通过下调靶基因E2F1、LASP-1与Ran的表达水平,显著性抑制食管癌细胞的增殖与迁移。本论文设计制备了携载miR-203的pH响应性纳米粒子并研究了其在抑制食道癌细胞中的作用方式及机制,为食管癌的治疗探索了新的思路和方法。
【关键词】：pH响应性纳米胶囊 O-羧甲基壳聚糖 细胞穿膜肽 miR-203
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩写词7-10
• 第1章 绪论10-18
• 1.1 食管鳞癌简介10-11
• 1.1.1 食管鳞癌的特征10
• 1.1.2 食管鳞癌的治疗现状及进展10-11
• 1.2 MicroRNA简介11-12
• 1.2.1 MicroRNA的作用机制11
• 1.2.2 MicroRNA与肿瘤治疗11-12
• 1.2.3 MicroRNA-203在食管癌治疗中的应用12
• 1.3 纳米载体系统简介12-15
• 1.3.1 纳米载体的分类与发展12-14
• 1.3.2 纳米载体系统递送miRNA的优势14
• 1.3.3 细胞穿膜肽概述14-15
• 1.3.4 O-羧甲基壳聚糖概述15
• 1.4 本文的研究内容及意义15-18
• 第2章 pH响应性纳米胶囊M-CTNs的制备与表征18-28
• 2.1 实验材料18
• 2.2 实验仪器18-19
• 2.3 实验方法19-21
• 2.3.1 M-CTNs的制备过程19
• 2.3.2 B-CTNs及M-CTNs的粒径与表面电位19-20
• 2.3.3 B-CTNs及M-CTNs的形态观察20
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳验证M-CTNs包载miR-203的能力20
• 2.3.5 M-CTNs的血清稳定性检测20
• 2.3.6 M-CTNs体外释放miR-203速率的测定20-21
• 2.3.7 统计学分析21
• 2.4 实验结果与讨论21-26
• 2.4.1 M-CTNs的制备21
• 2.4.2 M-CTNs各成分比例的优化21-22
• 2.4.3 B-CTNs及M-CTNs的形态观察22-23
• 2.4.4 M-CTNs包载miR-203的能力23-24
• 2.4.5 M-CTNs的血清稳定性检测24
• 2.4.6 M-CTNs的pH响应性能24-25
• 2.4.7 M-CTNs体外释放miR-203的速率25-26
• 2.5 本章小结26-28
• 第3章 M-CTNs治疗食管鳞癌作用的研究28-50
• 3.1 实验材料及溶液配制29-30
• 3.1.1 实验材料29-30
• 3.1.2 溶液配制30
• 3.2 实验仪器30-31
• 3.3 实验方法31-41
• 3.3.1 食管鳞癌细胞Ec-109的传代培养31
• 3.3.2 流式细胞仪检测M-CTNs转染效率31-32
• 3.3.3 激光共聚焦显微镜观察M-CTNs纳米颗粒的溶酶体逃逸能力32-33
• 3.3.4 Real-time PCR检测转染后细胞内miR-203的表达水平33-35
• 3.3.5 Real-time PCR检测靶基因mRNA表达水平35-37
• 3.3.6 Western Blot检测靶基因蛋白表达水平37-39
• 3.3.7 CCK8法检测Ec-109细胞增殖能力39-40
• 3.3.8 Transwell检测Ec-109细胞迁移能力40-41
• 3.3.9 统计学分析41
• 3.4 实验结果与讨论41-49
• 3.4.1 M-CTNs的转染效率41
• 3.4.2 M-CTNs的溶酶体逃逸功能41-43
• 3.4.3 转染后细胞内miR-203的表达水平43-44
• 3.4.4 靶基因E2F1、LASP-1 和Ran的mRNA表达水平44-45
• 3.4.5 靶基因E2F1、LASP-1 和Ran的蛋白质表达水平45-46
• 3.4.6 M-CTNs抑制Ec-109细胞的增殖能力46-47
• 3.4.7 M-CTNs抑制Ec-109细胞的迁移能力47-49
• 3.5 本章小结49-50
• 结论50-52
• 参考文献52-58
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文58-60
• 致谢60

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本文编号：702246