SIRT1在胃癌组织中的表达及其机制研究

发布时间：2017-08-19 21:05

  本文关键词：SIRT1在胃癌组织中的表达及其机制研究

  更多相关文章： SIRT1 胃癌 Cyclin D1 真核表达载体 重组质粒

【摘要】：目的：检测101例胃癌组织中SIRT1、β-catenin的表达水平并探讨其与胃癌临床病理参数的相关性。通过克隆SIRT1基因的全长cDNA构建含有SIRT1及其突变体T200I和E420K基因的重组真核表达载体,从而进一步研究在胃癌发生发展过程中SIRT1及其突变体所发挥的生物学功能。方法：收集101例滨州医学院附属医院手术切除的胃癌组织,制作石蜡标本,通过免疫组织化学染色检测SIRT1、β-catenin的表达并分析其与肿瘤临床病理特征的相关性。RT-PCR实验方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,其扩增产物通过双酶切被克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而使SIRT1基因表达增加。同时采用定点突变的方法构建SIRT1基因的突变体T200I和E420K,进而获得其真核表达载体pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K。重组质粒通过酶切和DNA测序比对得以鉴定,同时采用Western blotting实验从蛋白水平上证实重组真核表达载体构建成功。制备感受态细胞、做质粒转化并通过质粒抽提获取足量的pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)-T200I、pcDNA3.1(+)-E420K真核表达载体,然后将其通过脂质体转染的方法转染到293T细胞中,分别采用MTT、流式细胞术的方法检测无DNA转染的空白对照(空白组)、空载体pcDNA3.1(+)(空载组)、重组载体pcDNA3.1(+)- STRT1(WT组)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I组)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K组)五组细胞的增殖及细胞周期改变情况,并且采用Western blot实验检测五组细胞中Cyclin D1的表达。SIRT1抑制剂NAM处理293T细胞后检测其细胞体外增殖能力以及Cyclin D1的表达情况。结果：胃癌组织中SIRT1、β-catenin基因在的阳性表达率分别为64.4%(65/101)和47.5%(48/101),并且SIRT1在不同胃癌组织学分型中的表达差异有统计学意义(P0.05); SIRT1的高表达与胃癌肿瘤大小、发生部位、淋巴结转移情况及β-catenin的表达之间的差异无统计学意义(P0.05),SIRT1表达与β-catenin的表达无相关性(r=0.01；P=0.751)。通过获得并扩增SIRT1基因的全长cDNA,构建了SIRT1基因的pcDNA3.1(+)-SIRT1重组质粒及其突变体基因的pcDNA3.1(+)-T200I和pcDNA3.1(+)-E420K真核表达载体。将其使用酶切以及DNA测序比对测定后证实阳性重组质粒与预期序列完全相符。转染293T细胞,MTT实验显示重组载体pcDNA3.1(+)-STRT1(WT组)、pcDNA3.1(+)-T200I(T200I组)、pcDNA3.1(+)-E420K (E420K组)的细胞增殖能力高于无DNA转染的空白对照(空白组)和空载体pcDNA3.1(+)(空载组)(P0.05),而WT组、T200I组和E420K组三组之间的细胞增殖能力无显著差异(P0.05)。SIRT1抑制剂NAM处理293T细胞后其细胞体外增殖能力降低。通过流式细胞术分析各组细胞的细胞周期,结果显示WT组、T200I组和E420K组三组细胞的生长分数(S期+G2期细胞所占比例)高于空白组和空载组细胞(P0.05),但该三组细胞之间细胞周期改变不显著(P0.05)。Western blotting实验也证实了WT组、T200I组和E420K组三组细胞的细胞周期相关蛋白Cyclin D1高表达,而采用SIRT1抑制剂处理后细胞中Cyclin D1低表达。结论：本研究证实SIRT1在肠型胃癌中的表达明显高于弥漫性胃癌,由此说明SIRT1在不同组织学类型的胃癌中可能发挥的作用不同。我们成功构建了SIRT1及其突变体基因pcDNA3.1(+)-SIRT1、pcDNA3.1(+)- T200I和pcDNA3.1(+)-E420K的真核表达载体,提供了足够的SIRT1及其突变体基因的研究材料,有利于进行SIRT1的生物学功能研究。上调SIRT1及其突变体基因能够促进促进细胞的体外增殖能力和细胞周期的进展,下调SIRT1基因的表达抑制细胞的体外增殖能力和细胞周期的进展,其机制可能与改变了CyclinD1的表达相关。而SIRT1基因的突变体T200I和E420K对细胞增殖和细胞周期没有影响。本研究显示SIRT1在胃癌的发生发展中有可能发挥促癌基因的作用,这提示我们SIRT1的抑制剂有可能具有临床应用的潜在价值。
【关键词】：SIRT1 胃癌 Cyclin D1 真核表达载体 重组质粒
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 缩略词表10-12
• 前言12-14
• 第一部分 SIRT1在胃癌组织中的表达及临床意义14-27
• 1. 材料与方法14-19
• 2. 结果19-21
• 3. 讨论21-24
• 参考文献24-27
• 第二部分 SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定27-40
• 1. 材料和方法27-33
• 2. 结果33-35
• 3. 讨论35-38
• 参考文献38-40
• 第三部分 SIRT1基因及其突变体对293T细胞增殖及细胞周期的影响40-56
• 1. 材料与方法40-47
• 2. 结果47-51
• 3. 讨论51-54
• 参考文献54-56
• 全文总结56-57
• 文献综述 Sirtl与肿瘤耐药的研究进展57-66
• 参考文献63-66
• 致谢66-67
• 硕士期间发表论文情况67

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本文编号：702943