TC-1介导TRE17癌基因诱导的人MCF-7乳腺癌细胞迁移

发布时间：2017-08-21 04:03

  本文关键词：TC-1介导TRE17癌基因诱导的人MCF-7乳腺癌细胞迁移

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【摘要】：[研究目的]TRE17(也称为TRE2或USP6)癌基因最早发现于人Ewing肉瘤,高表达于平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和乳腺癌等,能使正常成纤维细胞NIH 3T3发生恶性转化和在裸鼠体内形成肿瘤。然而,TRE17的致瘤机制和对肿瘤细胞侵袭、转移的影响尚未清楚。甲状腺癌基因-1(TC-1,又名C8orf4),高表达于胃癌,肺癌,乳腺癌和结肠癌并且可以使正常甲状腺细胞恶性转化。TC-1能和Chibby竞争性结合(3-catenin,从而使Chibby对β-catenin蛋白的拮抗作用减弱,进而上调Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因,如MMP、VEGF、 TCF,这些靶基因均已被证实与肿瘤细胞的侵袭、转移及增殖等行为密切相关。我们的前期基因芯片结果提示TRE17高表达可上调人乳腺癌MCF-7细胞中TC-1水平。因此,本实验主要探讨TRE17通过TC-1上调Wnt/β-catenin信号促进人MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制,以进一步阐释癌基因TRE17在肿瘤发生发展中的作用。[研究方法]1.为了研究TRE17高表达对乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响,我们将Flag-TRE17和空载体Flag-pcDNA3.0质粒分别转染MCF-7和HEK293细胞,应用Transwell迁移实验和划痕实验分析TRE17高表达对细胞迁移能力的影响。2.为了探讨TRE17影响细胞迁移能力的机制,我们采用基因芯片技术筛选TRE17高表达的差异表达基因。以Flag空载体为对照,用癌基因TRE17转染人MCF7乳腺癌细胞,对照和实验各送2例进行基因芯片检测,基因芯片结果提示,TRE17转染的乳腺癌细胞中差异表达基因上调的多达404种,本实验室对上调倍数较高的基因进行验证实验,其中,用RealTime-PCR和WesternBlot方法观察了TRE17癌基因高表达对MCF-7细胞TC-1mRNA和蛋白水平的影响。TRE17是由USP32和TBC1D3融合而成。为了进一步明确TRE17各结构域在其调节MCF-7细胞TC-1表达中的作用,我们用TBC结构域部分缺失突变体Flag-TRE17 (△59-116)、Flag-TRE17 (△117-174)和钙调蛋白(Camodulin, CaM)结合位点突变体Flag-TRE17 (F328E)、USP结构域中USP活性位点突变体Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17分别转染MCF-7细胞,用Western blot方法检测细胞裂解物中TC-1蛋白水平。3.TC-1高表达能使人正常乳腺上皮细胞恶性转化为肿瘤细胞,但对乳腺癌细胞迁移性是否有影响还未见报道。为了观察TC-1在乳腺癌MCF-7细胞迁移中的作用,我们构建了TC-1真核表达质粒：从MCF-7细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增TC-1 cDNA全长开放读码框架(open reading frame, ORF),并插入真核表达载体Flag-pcDNA3.0中,构建了TC-1真核表达质粒Flag-TC-1/pcDNA3.0;将此重组质粒转染人MCF-7细胞,进行Western blot分析,鉴定重组质粒融合蛋白Flag-TC-1表达；将空载体和重组质粒分别转染MCF-7、BT549细胞,进行Trans well迁移实验和划痕实验,分析TC-1高表达在乳腺癌迁移中的作用。4.为了明确TC-1在TRE17影响的MCF-7细胞迁移中的作用,我们构建了靶向人TC-1基因不同部位的TC-1 shRNA慢病毒载体TC-1 (653) shRNA、 TC-1(1512) shRNA和TC-1(1566) shRNA及对照慢病毒载体NC shRNA,分别感染MCF-7细胞系,用Western blot检测TC-1蛋白表达水平,明确TC-1特异性shRNA的有效性；随后,以Flag空载体为对照,用Flag-TRE17分别转染NC shRNA或TC-1 (1566) shRNA感染的MCF-7细胞,进行Trans well迁移实验。已有研究表明TC-1癌蛋白能增强Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因(包括细胞迁移相关基因)转录。为了探讨Wnt/β-catenin信号通路在TRE17影响MCF-7细胞迁移中的作用,我们用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939处理MCF-7,并进行Transwell迁移实验。[研究结果]1. 为探讨TRE17癌基因表达对细胞迁移的影响,我们进行了Transwell小室细胞迁移实验。结果显示,用Flag-TRE17转染的MCF-7细胞迁移数显著多于用Flag空载体转染的MCF-7细胞迁移数；与此相似,TRE17高表达的HEK293细胞迁移能力也明显强于对照组HEK293-Flag。细胞划痕实验结果同样显示,高表达TRE17的MCF-7细胞迁移能力明显增强。这些结果表明,TRE17高表达促进细胞迁移。2. 为了深入研究TRE17促进细胞迁移的分子机制,我们用基因芯片技术筛选了TRE17在MCF-7细胞中高表达的差异表达基因,发现TRE17转染的乳腺癌细胞中差异表达基因多达404种。在用FLAG-pcDNA3.0空载质粒和FLAG-TRE17-pcDNA3.0重组质粒分别转染MCF-7细胞,提取细胞总RNA后,用Real-Time RT-PCR方法对某些差异表达基因进行了验证实验,其中,高表达TRE17的人MCF7乳腺癌细胞中TC-1 mRNA表达增加2倍以上。用Western blot方法进行研究的结果显示,Flag转染的MCF-7细胞中内源性TC-1蛋白水平较低,而用TRE17转染的细胞中TC-1蛋白表达显著增加。这些结果表明,TRE17高表达能促进MCF-7细胞中TC-1基因mRNA和蛋白表达。用TBC结构域部分缺失突变体Flag-TRE17 (△59-116)、Flag-TRE17 (△117-174)和钙调蛋白(Camodulin, CaM)结合位点突变体Flag-TRE17 (F328E)、 USP结构域中USP活性位点突变体Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17和空载体Flag-pcDNA3.0进行研究的结果显示,与空载体对照相比,Flag-TRE17及突变体Flag-TRE17 (F328E)和Flag-TRE17(-USP)高表达均能增加MCF-7细胞中TC-1蛋白水平,但TBC结构域部分缺失突变体Flag-TRE17 (△59-116)和Flag-TRE17 (△117-174)丧失了促进TC-1蛋白表达的作用。这些结果提示,TRE17促进MCF-7细胞TC-1表达的作用依赖于其TBC结构域,但不依赖于USP结构域,而CaM结合与否并不影响TRE17刺激TC-1表达的作用。3. 为了探讨TC-1高表达对乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响,我们用RT-PCR方法克隆了的人TC-1 cDNA完整ORF,经琼脂糖凝胶电泳后出现1条337bp左右的DNA条带,大小与预期相符。回收的该RT-PCR产物经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳和回收纯化后,与经同样双酶切的真核表达载体Flag-pcDNA3.0质粒连接,生成重组质粒Flag-TC-1-pcDNA3.0。该质粒经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切时出现327 bp特征性片段；DNA序列测定证实序列无误。随后,用Flag-pcDNA3.0空载体和Flag-TC-1-pcDNA3.0重组质粒分别转染人MCF-7乳腺癌细胞,进行Transwell迁移实验,结果显示TC-1高表达的MCF-7细胞迁移能力明显强于对照组MCF-7-Flag。与此相似,用人BT549乳腺癌细胞进行划痕实验的结果显示,在划痕后12小时,空载体转染的BT549细胞的划痕大小几乎无明显变化,而TC-1转染细胞的划痕已缩小近50%；在24小时后,空载体对照细胞的划痕大小仅缩小不到三分之一,而高表达TC-1的BT549癌细胞的划痕已接近消失。这些结果表明,TC-1高表达能增强人乳腺癌细胞的迁移性。4.为了明确TC-1在TRE17诱导的MCF-7细胞迁移中的作用,我们以Flag空载体为对照,用Flag-TRE17分别转染NC shRNA对照或特异性抑制TC-1表达的shRNA慢病毒载体TC-1 (1566) shRNA感染的MCF-7细胞,进行Transwell迁移实验。结果显示,在细胞内TC-1蛋白水平未被敲低时,TRE17癌蛋白高表达显著增加MCF-7细胞迁移；而用RNA干扰技术敲低TC-1后,既能抑制TRE17未高表达的MCF-7细胞迁移,也能抑制TRE17高表达诱导的MCF-7迁移,各组之间有显著统计学差异(P0.05)。这些结果提示,TC-1癌蛋白调节人MCF-7乳腺癌细胞迁移,并且至少部分介导TRE17癌蛋白诱导的MCF-7细胞迁移。用Wnt/p-catenin信号通路抑制剂XAV-939处理MCF-7的Transwell迁移实验结果显示,TRE17和TC-1癌蛋白分别高表达均能促进MCF-7细胞迁移,而加入药物XAV-939抑制Wnt/β-catenin信号通路后,不仅转染空载体的MCF-7细胞迁移明显减弱,而且TRE17和TC-1促进MCF-7细胞迁移的作用也丧失(P0.05)。这些结果提示,TRE17可能通过TC-1/Wnt/β-catenin信号通路促进人MCF-7乳腺癌细胞迁移。[结论]1 TRE17高表达能促进人MCF-7乳腺癌细胞迁移；2在人MCF-7细胞中,TRE17癌基因依赖TBC域促进TC-1蛋白水平上调；3TRE17可能部分通过调节TC-1的表达促进人MCF-7细胞的迁移；4TRE17可能通过调节TC-1下游的Wnt-β-catenin信号通路促进MCF-7细胞的迁移。
【关键词】：癌基因 TRE17 迁移 甲状腺癌基因TC-1 Wnt-β-catenin信号通路
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-17
• 缩略语17-19
• 前言19-21
• 文献综述 TC-1在乳腺癌细胞中wnt/信号转导的作用机制研究21-26
• 第一章 癌蛋白TRE17高表达促进人MCF-7乳腺癌细胞迁移26-36
• 1 实验材料26-29
• 2 实验方法29-33
• 3 结果33-36
• 第二章 癌蛋白TRE17高表达促进人MCF-7乳腺癌细胞中TC-1癌基因上调36-43
• 1 实验材料36-37
• 2 试验方法37-40
• 3 结果40-43
• 第三章 癌蛋白TC-1高表达促进人MCF-7乳腺癌细胞迁移43-54
• 1 实验材料43-44
• 2 实验方法44-50
• 3 实验结果50-54
• 第四章 敲低TC-1抑制TRE17诱导的人MCF-7乳腺癌细胞迁移54-58
• 1 实验材料54
• 2 试验方法54-55
• 3 实验结果55-58
• 讨论58-60
• 结论60-61
• 参考文献61-64
• 致谢64-65
• 作者简介65-66
• 附件66-67

【参考文献】

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1 孙晓楠;郭卫东;张惠洁;;TC-1在Wnt/β-catenin信号通路中的研究进展[J];中国冶金工业医学杂志;2014年01期

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本文编号：710683