ART1对uPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用

发布时间：2017-08-22 03:13

  本文关键词：ART1对uPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用

  更多相关文章： 精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 DNA甲基转移酶1 DNA甲基化 侵袭 转移

【摘要】：目的：探究精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1(Arginine-specific mono-ADP-ribosytransferases-1, ART1)对uPA基因启动子甲基化的影响及其在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用。方法：本实验以CT26细胞ART1高表达组(GFP-ART1)、ART1沉默组(GFP-shARTl)为实验组,CT26细胞空载体组(GFP-Vector组)、未转染组(Un-transfection组)为对照组,western blot测定不同组别DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达变化,同时,ART1高表达组、ART1沉默组、空载体组及未转染组CT26细胞分别接种于BALB/C小鼠,构建各组别BALB/C小鼠脾脏移植瘤模型并提取各组移植瘤组织蛋白,Western blot测定不同组别DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达变化。DNA甲基化特异性PCR测序法检测不同组别uPA基因启动子甲基化状态变化；免疫共沉淀方法观察CT26细胞ART1高表达组、空载体组及未转染组ART1与DNMT1之间的关系。应用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-dc)处理ART1沉默组CT26细胞,划痕实验和Transwell侵袭实验观察细胞迁移及侵袭能力的变化。BALB/C小鼠脾脏接种ART1基因沉默CT26细胞,腹腔注射5-aza-2-dc,与对照组比较小鼠脾脏移植瘤细胞肝转移情况。采用western blot检测GFP-shARTl、GFP-ART1、Un-transfection及GFP-Vector各组肿瘤细胞uPA表达变化,同时检测各组细胞脾脏移植瘤uPA表达变化,并应用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2-dc处理ART1沉默组CT26细胞,western blot方法检测其uPA表达变化,同时检测5-aza-2-dc处理沉默组与未处理沉默组脾脏移植瘤uPA表达变化。结果：(1)ARTl对小鼠结肠癌CT26细胞uPA基因启动子甲基化水平的影响：western blot方法检测ART1高表达组、ART1沉默组、未转染组、空载体组CT26细胞DNMT1表达变化,结果显示,与对照组相比,ART1高表达组DNMT1表达减少,而ART1沉默组DNMT1表达增加(P0.01)；同时检测各组小鼠脾脏移植瘤蛋白中DNMT1表达变化,结果显示同样的趋势(P0.01)；采用DNA甲基化特异性PCR测序方法测定uPA启动子甲基化水平在各组的变化,结果显示与对照组相比,ART1高表达组uPA基因启动子甲基化水平降低,而ART1沉默组uPA基因启动子甲基化水平升高。免疫共沉淀结果显示ART1与DNMT1之间尚未发生直接的结合。(2)ARTl通过对uPA基因启动子甲基化状态的影响导致其表达变化及其在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭、转移能力的作用：细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测5-aza-2-dc处理组和未处理组CT26沉默细胞迁移及侵袭能力,结果显示与未处理组相比,5-aza-2-dc处理组细胞24h迁移距离明显增高(P0.01),且降解Matrigel基质胶穿过小室的细胞数明显升高(P0.01)。采用5-aza-dc处理沉默组CT26细胞构建小鼠脾脏移植瘤模型,观察小鼠肝转移情况,结果显示与未处理组相比,处理组小鼠肝转移模型的肝脏转移结节数(P0.05)和肝脏重量显著增加(P0.05)。采用western blot方法检测ARTl高表达组,ART1沉默组,未转染组,空载体组CT26细胞uPA表达变化,结果显示与对照组相比,GFP-ART1组uPA表达增加,而GFP-shART1组uPA表达减少(P0.01)；同时检测各组小鼠脾脏移植瘤蛋白中uPA表达变化,结果显示同样的趋势(P0.01)；采用5-aza-2-dc处理沉默组细胞后,显示uPA表达增加(P0.01)；同时western blot方法检测5-aza-2-dc处理组与未处理组CT26沉默细胞移植瘤蛋白结果显示,与未处理组相比,uPA表达显著增加(P0.01)。结论：ART1沉默能够促进DNMT1表达,促进侵袭转移相关基因uPA启动子高甲基化,引起uPA蛋白表达减少,相反ART1高表达,则使DNMT1表达降低,uPA启动子甲基化程度降低,其蛋白表达增加,同时,抑制DNMT1, uPA基因蛋白表达增加,CT26细胞侵袭、转移能力增强,提示ARTl可通过抑制uPA基因启动子甲基化,而促进其表达,从而在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中发挥促进作用。其详细的机制仍有待深入探究。
【关键词】：精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 DNA甲基转移酶1 DNA甲基化 侵袭 转移
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分 ART1对UPA基因启动子甲基化的影响15-25
• 1 实验材料15-16
• 2 实验方法16-21
• 3 实验结果21-22
• 4 讨论22-25
• 第二部分 ART1对UPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用25-35
• 1 实验材料25-26
• 2 实验方法26-28
• 3 实验结果28-33
• 4 讨论33-35
• 全文总结35-37
• 参考文献37-41
• 附图41-42
• 文献综述42-48
• 参考文献45-48
• 致谢48-49
• 硕士期间发表论文情况49

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本文编号：716712