重组溶瘤腺病毒对人肿瘤细胞的体内、外抑制作用研究

发布时间：2017-08-22 11:26

  本文关键词：重组溶瘤腺病毒对人肿瘤细胞的体内、外抑制作用研究

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【摘要】：近年来我国癌症的发病率和死亡率逐年攀升,严重威胁着人类健康及生命。据统计仅2015年中国新增癌症患者人数约为429.2万,死亡人数约为281.4万。目前临床上多采用手术和放化疗法治疗癌症,但因上述疗法缺乏对肿瘤细胞的特异性,导致治疗过程中正常细胞也严重受损,因此急需探索肿瘤治疗的新方法。基因治疗是一种恶性肿瘤的生物疗法,但关键问题是如何安全高效地将治疗基因递送至人体内。目前肿瘤基因治疗中腺病毒载体应用最广泛,溶瘤腺病毒的优势是仅杀伤肿瘤细胞但不伤害正常细胞,因此可作为一种抗肿瘤基因药物加以应用。凋亡素(Apoptin)是鸡贫血病毒VP3基因编码的一种功能蛋白,仅在肿瘤细胞内复制;血凝素-神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒的一种表面蛋白,能激活细胞凋亡途径。因此本研究构建表达Apoptin和HN的重组腺病毒Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a),研究其是否能成为有效的抗肿瘤基因药物。本研究分别用Ad-VT感染人骨肉瘤和正常细胞,以及用Ad-HN-PEG3p-E1a感染人胃癌细胞。通过MTT法检测重组腺病毒对肿瘤细胞和正常细胞的增殖抑制率。体外实验中,在荧光显微镜下观察肿瘤细胞和正常细胞经AO/EB染色、DAPI染色后的形态学变化;再利用Annexin V/PI方法通过流式细胞术和染色分析重组腺病毒对肿瘤细胞的抑制作用方式,并通过Caspase酶活性检测以上重组腺病毒对肿瘤细胞的抑制作用途径。体内实验中,采取构建动物模型并考察肿瘤生长趋势和平均生存期。Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能抑制两种肿瘤细胞增殖,并伴随一定的时间效应和剂量效应关系,但对正常细胞无影响。体外实验中验证了以上两种重组腺病毒能诱导肿瘤细胞凋亡,且是通过激活Caspase相关酶方式实现的。体内实验中,Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能有效减缓瘤体生长并能延长平均生存期。结果表明,Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)对肿瘤细胞有特异性抑制作用,对于今后肿瘤治疗的临床应用具有一定的参考价值。
【关键词】：溶瘤腺病毒 凋亡素 病毒载体 癌症
【学位授予单位】：长春工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 英文缩略语8-9
• 第一章 绪论9-19
• 1.1 癌症与基因治疗9-10
• 1.2 基因转移方法10
• 1.3 非病毒载体10-12
• 1.3.1 生物载体10-12
• 1.3.2 非传统生物载体12
• 1.4 病毒载体12-16
• 1.4.1 腺病毒载体13-14
• 1.4.2 γ 反转录病毒载体和慢病毒载体14-15
• 1.4.3 疱疹病毒15
• 1.4.4 腺相关病毒15-16
• 1.5 体外细胞基因治疗16-17
• 1.5.1 细胞的选择16-17
• 1.5.2 载体的选择17
• 1.6 基因治疗面临的挑战17-19
• 1.6.1 安全性问题17-18
• 1.6.2 转基因表达18
• 1.6.3 从实验室研究到临床应用18-19
• 第二章 重组腺病毒有效抑制人肿瘤细胞增殖19-31
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 重组腺病毒19
• 2.1.2 细胞19
• 2.1.3 试剂19-20
• 2.1.4 仪器设备20
• 2.2 实验方法20-21
• 2.2.1 复苏和传代HEK-293细胞20
• 2.2.2 扩增重组腺病毒20-21
• 2.2.3 测定重组腺病毒毒价21
• 2.2.4 MTT检测21
• 2.3 结果21-29
• 2.3.1 Ad-VT作用时间对OS-732细胞的抑制作用22-23
• 2.3.2 Ad-VT作用时间对L02细胞的抑制作用23-24
• 2.3.3 Ad-VT作用剂量对OS-732细胞的抑制作用24-26
• 2.3.4 Ad-VT作用剂量对L02细胞的抑制作用26-27
• 2.3.5 Ad-HP对SGC7901细胞的抑制作用27-29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章 重组腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡31-41
• 3.1 实验材料和仪器31-32
• 3.1.1 重组腺病毒31
• 3.1.2 细胞31
• 3.1.3 试剂31-32
• 3.1.4 仪器设备32
• 3.2 实验方法32-33
• 3.2.1 AO/EB染色32
• 3.2.2 DAPI染色32
• 3.2.3 Annexin V检测32-33
• 3.2.4 Caspase活性检测33
• 3.3 结果33-39
• 3.3.1 AO/EB染色结果33-34
• 3.3.2 DAPI染色结果34-36
• 3.3.3 Annexin V检测结果36-37
• 3.3.4 Caspase活性检测结果37-39
• 3.4 讨论39-41
• 第四章 重组腺病毒的体内抑瘤作用41-46
• 4.1 实验材料41-42
• 4.1.1 重组腺病毒41
• 4.1.2 细胞41
• 4.1.3 实验动物41
• 4.1.4 试剂41-42
• 4.1.5 仪器设备42
• 4.2 实验方法42-43
• 4.2.1 重组腺病毒的纯化42
• 4.2.2 动物模型建立42
• 4.2.3 模型分组及治疗方案42
• 4.2.4 肿瘤生长趋势42-43
• 4.2.5 平均生存期43
• 4.3 结果43-44
• 4.3.1 肿瘤生长趋势43
• 4.3.2 平均生存期43-44
• 4.4 讨论44-46
• 第五章 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-54
• 作者简介54
• 攻读硕士学位期间研究成果54

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