Epha2的表达沉默对PC3细胞生物学行为及血管生成拟态的影响
发布时间：2017-08-22 15:27
本文关键词：Epha2的表达沉默对PC3细胞生物学行为及血管生成拟态的影响
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【摘要】：目的:应用siRNA干扰人前列腺癌PC3细胞EphA2的表达,探讨EphA2基因沉默后对前列腺癌PC3细胞包括生长增殖、迁移力、凋亡等细胞生物学行为及对血管生成拟态形成的影响,从而为前列腺癌的基因靶向治疗提供实验依据。方法:培养人前列腺癌PC3细胞株(高表达EGFR,对EGFR-TK1吉非替尼敏感),根据条件转染或不转染siRNA,24h后分别在RNA水平与蛋白水平观察Epha2的下调效果,筛选出对Epha2基因表达具有有效下调作用的siRNA序列,并利用筛选得到的有效siRNA转染PC3细胞;实验分为PC3组、PC3+NC siRNA组和PC3+EphA2siRNA组;转染细胞后,加入吉非替尼共培养48小时后,使用流式细胞仪检测细胞凋亡;MTT方法检测细胞增殖;Transwell法观察三组细胞侵袭力的变化;同时,观察转染后对三维培养条件下PC3血管生成拟态的影响。结果:(1)筛选有效的siRNA序列:Realtime PCR结果显示,与空白组相比,阴性对照组无显著差异;转染siRNA-444、siRNA-733、siRNA-1533、siRNA-2191组EphA2表达水平分别下调54.60%(P0.0001)、52.01%(P0.0001)、93.50%(P0.0001)、74.23%(P0.0001),说明这些siRNA序列能有效沉默EphA2基因。WesternBlot结果显示,与空白组相比,阴性对照组无显著差异,转染sirna-444、sirna-733、sirna-1533、sirna-2191组蛋白表达水平分别下调46.76%(p0.001)、45.02%(p0.001)、80.02%(p0.001)、64.30%(p0.001),说明这些sirna序列能有效抑制epha2基因表达,其中sirna-1533的下调作用最明显。(2).mtt法检测转染后0h、24h、48h、72h三组细胞增殖水平,根据测得的od值比较各组细胞的生存情况,发现在48h、72h时pc3+epha2sirna组细胞存活数较两对组差异均具有统计学意义(p0.05),但72h时epha2干扰作用最明显(f=51.23,p0.01);(3).transwell法测转染后三组细胞侵袭力,结果显示:pc3+epha2sirna组穿过matrigel胶的细胞数明显少于pc3组和pc3+ncsirna组(f=29.00,p0.01),而pc3组和pc3+ncsirna组之间无明显差别(p0.05);(4).流式细胞仪技术测转染后48h三组细胞凋亡率,结果显示:pc3+epha2sirna组细胞的平均凋亡率为(17.56±1.21)%,pc3组平均凋亡率为(3.98±0.24)%,pc3+ncsirna组细胞平均凋亡率为(4.02±0.28)%,pc3+epha2sirna组较pc3组和pc3+ncsirna组细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(f=148.14,p0.01),而pc3组和pc3+ncsirna组细胞凋亡率差异无统计学意义(p0.05);(5).转染48h后将三组细胞行体外三维培养,24h后终止培养,观察各组细胞的管状结构排列情况和完整程度。结果显示:pc3+epha2sirna组管状结构数目为8.5±2.3,pc3组和pc3+ncsirna组细胞管状结构数目分别为和15.4±3.6和14.2±1.8,pc3+epha2sirna组较pc3组和pc3+ncsirna组管状结构数目明显减少,差异有统计学意义(f=58,p0.01),而PC3组和PC3+NC siRNA组管状结构数目无统计学意义(P0.05)。结论:(1).沉默EphA2基因能抑制前列腺癌PC3细胞的生长及血管生成拟态的形成、降低其侵袭力、诱导细胞凋亡;(2).针对EphA2的基因干扰技术能够为前列腺癌的治疗提供新的思路。
【关键词】：前列腺癌 PC3细胞 EphA2 RNA干扰 生物学性状 血管生成拟态
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：
- 中文摘要5-8
- 英文摘要8-11
- 引言11-14
- 实验流程14-15
- 材料与方法15-18
- 实验方法18-30
- 结果30-43
- 讨论43-50
- 结论50-51
- 参考文献51-54
- 综述54-60
- 参考文献58-60
- 攻读学位期间公开发表的论文60-61
- 致谢61
【参考文献】
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，本文编号：719909
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