鼻咽癌靶向基因传递载体的研究

发布时间：2017-08-23 07:47

  本文关键词：鼻咽癌靶向基因传递载体的研究

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【摘要】：随着近年来肿瘤发病率的不断提升，恶性肿瘤对人类构成了极大的威胁。鼻咽癌是原发于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，对大多数地区而言，鼻咽癌是一种发病率较低的肿瘤，然而却是我国常见的肿瘤之一。常用的癌症治疗手段在鼻咽癌晚期的治疗上收效并不高，鼻咽癌的基因治疗方法的建立可以为传统疗法提供必要的补充，具有重要意义。其中，有效的治疗基因、安全且体液条件下转染效率高的传递载体是有待解决的两个关键限制因素。 本课题在实验室前期研究的基础上，采用叶酸为导向分子，将阳离子脂质体、PEI和NLS等提高转染的特殊功能相联合，利用改进的新方法制备靶向鼻咽癌的多功能基因传递载体。 首先考察TRAIL基因对于鼻咽癌细胞的杀伤作用。通过对细胞表面TRAIL受体进行检测，细胞凋亡状态观察，MTT检测最终确定TRAIL可诱导人鼻咽癌CNE、HNE-1细胞的凋亡，达到杀伤癌细胞目的，可以作为鼻咽癌基因治疗的候选基因。 将NLS以不同比例分别与PEI和阳离子脂质体形成复合载体，细胞转染和细胞毒性实验结果表明，NLS在适当的优化比例下可显著提高非病毒载体的转染效率。 改进脂质体、PEI、DNA的复合方法，从实验室前期建立的二步复合法优化为一步复合。采用优化后的一步法制备得到粒径150nm左右、表面电位45mV左右的PEIlip/DNA复合物。细胞转染和细胞毒性实验结果表明，PEIlip/DNA具有良好的安全性和更高的转染效率，，且转染不受血清的影响。 ELISA检测证明鼻咽癌CNE、HNE-1细胞表面高表达叶酸受体，为叶酸作为鼻咽癌基因传递载体的导向分子提供理论依据。制备荧光标记的叶酸修饰脂质体，荧光显微镜下观察到其对鼻咽癌细胞CNE具有靶向识别和入胞的功能。 制备叶酸修饰的fPEG-PEIlip/DNA复合物，细胞转染实验结果表明，叶酸修饰可以显著提高复合物对鼻咽癌细胞的转染效率，而NLS的加入能够进一步提高转染效率。。 综上所述，本文成功的制备了一种可以靶向鼻咽癌基因传递载体，该载体安全性好、转染效率高体，是一种具有应用潜力的鼻咽癌基因治疗载体。
【关键词】：鼻咽癌 基因传递载体 靶向脂质体 PEI NLS
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩写词表8-11
• 第一章 前言11-21
• 1.1 肿瘤的基因治疗11-12
• 1.2 TRAIL 治疗基因12-16
• 1.3 非病毒载体16-20
• 1.3.1 阳离子脂质体载体16-17
• 1.3.2 聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）17-18
• 1.3.3 核定位肽18-19
• 1.3.4 叶酸19-20
• 1.4 立题依据及实验设计20-21
• 第二章 实验材料与方法21-31
• 2.1 实验材料、试剂、仪器21-23
• 2.1.1 实验细胞、菌株、质粒21
• 2.1.2 主要试剂、材料21-22
• 2.1.3 主要仪器设备22-23
• 2.2 实验方法23-31
• 2.2.1 质粒 DNA 的转化、提取、质量检测23
• 2.2.2 细胞的复苏、培养、冻存23-24
• 2.2.3 细胞凋亡检测24-25
• 2.2.4 细胞表面 TRAIL 受体检测25
• 2.2.5 NLS/DNA 复合物的制备25
• 2.2.6 复合物粒径及电位的测定25-26
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳实验26
• 2.2.8 lipo2000/NLS/DNA 复合物的制备26
• 2.2.9 PEI/NLS/DNA 的制备26
• 2.2.10 体外细胞转染效率考察26-27
• 2.2.11 细胞毒性检测27-28
• 2.2.12 PEI/DNA 复合物的制备28
• 2.2.13 阳离子脂质体/PEI/DNA 复合物的制备28
• 2.2.14 PEIlip 的制备28-29
• 2.2.15 PEIlip/NLS/DNA 的制备29
• 2.2.16 细胞表面叶酸受体检测29-30
• 2.2.17 荧光叶酸脂质体的制备及考察30
• 2.2.18 叶酸脂质体的制备及性质考察30
• 2.2.19 叶酸脂质体/PEI/NLS/DNA 复合物的制备30
• 2.2.20 统计学分析30-31
• 第三章 结果与讨论31-50
• 3.1 TRAIL 基因对鼻咽癌细胞的促凋亡作用考察31-34
• 3.1.1 CNE、HNE-1 细胞膜表面 TRAIL 受体的检测31-32
• 3.1.2 TRAIL 基因对 CNE 细胞的促凋亡作用评价32-34
• 3.2 NLS 的促转染作用34-40
• 3.2.1 NLS/DNA 复合物的性质及制备考察34-35
• 3.2.2 NLS 对 PEI/DNA 的促转染作用35-38
• 3.2.3 NLS 对 lipo2000/DNA 的促转染作用38-39
• 3.2.4 小结39-40
• 3.3 阳离子脂质体与 PEI 复合载体制备方法改进及性质考察40-45
• 3.3.1 N/P 的影响40-41
• 3.3.2 超声与过膜处理对 PEIlip/DNA 复合物的影响41-43
• 3.3.3 两种方法制备三元复合物性质比较43-44
• 3.3.5 小结44-45
• 3.4 叶酸修饰复合物对鼻咽癌细胞的靶向作用45-50
• 3.4.1 细胞表面叶酸受体 ELLSA 检测45
• 3.4.2 叶酸脂质体的靶向作用45-47
• 3.4.3 叶酸修饰三元复合载体的靶向性47-49
• 3.4.4 小结49-50
• 全文总结50-51
• 参考文献51-59
• 作者简介59-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：723854