激素难治性前列腺癌耐药机制的初步研究

发布时间：2017-08-23 09:00

  本文关键词：激素难治性前列腺癌耐药机制的初步研究

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【摘要】：前列腺癌是一种最常见的男性恶性肿瘤,其死亡率在男性恶性肿瘤中高居第二位。中国男性的前列腺癌发病率虽低于西方一些国家,但是最近几年来由于环境等因素的变化,使得前列腺癌的发病率也在不断增加。前列腺癌的发生发展过程主要依靠雄激素受体,因此,雄激素去势疗法成为手术疗法和放射治疗之外的第三种标准治疗法。但是前列腺癌患者接受18-24个月的雄激素去势治疗后,大部分患者对雄激素去势治疗不再有效,而转变为激素难治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC),且容易发生骨转移,使治疗变得更加困难,死亡率也大大增加。因此对于HRPC转化机制的研究成为国内外前列腺癌治疗的研究热点。但是前列腺癌激素耐药的转化过程涉及的因素很多,目前已经发现的大量与前列腺癌产生耐药性相关的基因及信号通路都不能充分说明其耐药机制,需要进一步深入研究。此外,大部分HRPC的研究都以DU145、PC3等激素难治性细胞为模型,因其不表达内源性雄激素受体不能完全模拟临床HRPC的转化过程,因此,得到的信息是非常有限和不完整的,HRPC的形成机理尚不明确。本研究选择了具有人前列腺癌功能分化特征的,并有较强的雄激素依赖性的LNCa P细胞系,通过去雄激素的培养环境诱导建立雄激素抵抗性细胞模型LNCa P-HR,从而模拟临床上前列腺癌在接受激素去势治疗后转变为激素难治性前列腺癌的过程,以便用来探究HRPC转变过程中的细胞学和分子生物学相关机制。首先,利用基因芯片技术对LNCa P和LNCa P-HR细胞模型进行全基因表达谱的比较分析,结果得到表达上调基因20个,下调基因206个。对差异表达基因的功能进行归类分析,结果显示上调的基因主要涉及细胞内部基因调控、表达、代谢、可变剪切等功能,而表达下调的基因主要与膜蛋白、跨膜蛋白、离子结合、细胞间信号传导及基因表达调控等功能相关。结合生物学过程、差异表达基因的功能及已发表的文献,分析可能的信号通路,为探究HRPC的发生机制提供方向。根据基因芯片生物信息学分析结果,对PI3K/AKT途径、MAPK/ERK、MAPK/P38等信号通路关键蛋白进行检测,western blot结果显示,与LNCa P相比,LNCa P-HR的AKT下游的NF-κB蛋白表达升高,但AKT和P-AKT蛋白的表达均无显著变化,提示NF-κB可能是激素耐药相关信号通路中的关键位点,但它的激活不是通过PI3K/AKT信号通路实现的,可能通过其他的信号通路激活。MAPK信号通路关键蛋白的western blot结果显示,LNCa P-HR与LNCa P相比,ERK、P-ERK蛋白表达均无明显的变化,而P38、P-P38表达显著增高,提示MAPK/ERK信号通路在HRPC转化过程中没有发挥功能,而MAPK/p38信号通路在LNCa P转变为LNCa P-HR过程中则可能具有重要作用。以LNCa P和LNCa P-HR细胞作为激素依赖和激素难治性前列腺癌模型,对多种小分子抑制剂和天然产物进行筛选,发现番茄红素(Lycopene)作为一种天然的类胡萝卜素,能够明显的抑制前列腺癌细胞尤其是激素难治性细胞的增殖。细胞增殖实验结果显示,80μmol/L的番茄红素能有效抑制LNCa P细胞增殖,而40μmol/L的番茄红素就能有效抑制LNCa P-HR细胞,提示番茄红素能够更有效的抑制激素难治性前列腺癌细胞生长。进一步探究番茄红素发挥此作用的相关信号通路,结果显示番茄红素可以上调LNCa P和LNCa P-HR细胞P38、P-P38的表达,但对ERK、AKT、NF-κB的表达无明显作用,提示番茄红素可能通过MAPK/p38信号途径发挥抑瘤作用,该现象与前述HRPC转化的可能信号通路相符合。有研究报道MAPK/P38信号通路在卵巢癌、乳腺癌耐药机制中发挥了重要的作用,但在前列腺癌的耐药机制中尚无报道。本研究结果为HRPC机制的研究及HRPC的治疗提供了新的方向。
【关键词】：激素依赖性前列腺癌 激素难治性前列腺癌 机制 番茄红素
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文对照词表13-14
• 第1章 绪论14-21
• 1.1 前列腺癌14-16
• 1.1.1 前列腺癌的分类14-15
• 1.1.2 前列腺癌的分级15-16
• 1.1.3 前列腺癌的诊断及治疗16
• 1.2 激素难治性前列腺癌16-17
• 1.3 激素难治性前列腺癌转变机制17-19
• 1.3.1 雄激素受体信号通路17-18
• 1.3.2 非雄激素受体信号途径18-19
• 1.4 番茄红素19
• 1.5 立题依据19-21
• 第2章 材料与试剂21-25
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验仪器21-22
• 2.1.2 实验试剂22-23
• 2.1.3 细胞系23
• 2.2 主要试剂配制23-25
• 2.2.1 RPMI1640培养液配制23
• 2.2.2 PBS配制23
• 2.2.3 0.25%胰酶配制23
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳缓冲液配制（10×）23-24
• 2.2.5 Western blot转膜液配制（10×）24
• 2.2.6 TBS缓冲液配制（10×）24
• 2.2.7 TBST缓冲液配制24
• 2.2.8 封闭液配制24
• 2.2.9 10%（W/V)SDS溶液配制24
• 2.2.10 10%（W/V)过硫酸铵（APS）溶液配制24
• 2.2.11 上样缓冲液24
• 2.2.12 番茄红素溶液配制24-25
• 第3章 实验方法25-35
• 3.1 激素难治性前列腺癌细胞模型的建立25-27
• 3.1.1 前列腺癌LNCaP细胞的培养25
• 3.1.2 激素难治性前列腺癌LNCaP-HR细胞的诱导与培养25-26
• 3.1.3 去雄激素与氟他胺共培养的LNCaP-HR+F细胞的诱导与培养26
• 3.1.4 LNCaP、LNCa P-HR、LNCaP-HR+F细胞形态学观察26
• 3.1.5 细胞增殖能力的检测26
• 3.1.6 LNCaP-HR和LNCaP-HR+F细胞对氟他胺的抵抗性26-27
• 3.1.7 细胞侵袭能力的检测27
• 3.2 激素难治性前列腺癌基因表达的检测27-29
• 3.2.1 细胞RNA的提取27-28
• 3.2.2 基因芯片扫描28-29
• 3.2.3 基因芯片中差异表达基因的统计29
• 3.2.4 基因芯片中差异表达基因的聚类分析29
• 3.2.5 基因芯片中差异表达基因作用通路及潜在耐药基因分析29
• 3.3 激素难治性前列腺癌相关通路关键蛋白的检测29-31
• 3.3.1 前列腺癌细胞的培养29
• 3.3.2 细胞总蛋白的提取29-30
• 3.3.3 LNCaP和LNCa P-HR细胞AKT、P-AKT、NF-κB蛋白表达变化30-31
• 3.3.4 LNCaP和LNCa P-HR细胞ERK、P-ERK蛋白表达变化31
• 3.3.5 LNCaP和LNCa P-HR细胞P38、P-P38蛋白表达变化31
• 3.4 小分子药物及天然产物对激素难治性前列腺癌细胞的增殖影响31-32
• 3.4.1 细胞悬液的制备31-32
• 3.4.2 种板32
• 3.4.3 加药32
• 3.4.4 检测32
• 3.5 番茄红素对激素难治性前列腺癌细胞增殖的影响32-33
• 3.5.1 细胞悬液的制备32-33
• 3.5.2 种板33
• 3.5.3 加药33
• 3.5.4 检测33
• 3.6 番茄红素对激素难治性前列腺癌相关通路关键蛋白的影响33-34
• 3.6.1 前列腺癌细胞的培养33
• 3.6.2 番茄红素作用后LNCa P和LNCa P-HR细胞总蛋白的提取33-34
• 3.6.3 番茄红素作用后LNCaP和LNCa P-HR细胞AKT、P-AKT蛋白表达变化34
• 3.6.4 番茄红素作用后LNCaP和LNCa P-HR细胞ERK蛋白表达变化34
• 3.6.5 番茄红素作用后LNCaP和LNCa P-HR细胞P38蛋白表达变化34
• 3.7 统计学分析34-35
• 第4章 实验结果35-51
• 4.1 激素难治性前列腺癌细胞模型的建立35-38
• 4.1.1 前列腺癌LNCaP、LNCaP-HR、LNCaP-HR+F细胞形态学观察35
• 4.1.2 细胞增殖能力的变化35-36
• 4.1.3 LNCaP-HR和LNCaP-HR+F细胞对氟他胺的抵抗性36-37
• 4.1.4 细胞侵袭能力的变化37-38
• 4.2 激素难治性前列腺癌基因表达变化38-44
• 4.2.1 激素难治性LNCa P细胞差异表达基因的统计38-39
• 4.2.2 基因芯片中差异表达基因的聚类分析39
• 4.2.3 基因芯片中差异表达基因作用通路及潜在耐药基因分析39-44
• 4.3 激素难治性前列腺癌相关通路关键蛋白的检测44-46
• 4.3.1 LNCaP和LNCa P-HR细胞AKT、P-AKT、NF-κB蛋白表达变化44-45
• 4.3.2 LNCaP和LNCa P-HR细胞ERK、P-ERK蛋白表达变化45
• 4.3.3 LNCaP和LNCa P-HR细胞P38、P-P38蛋白表达变化45-46
• 4.4 小分子药物及天然产物对激素难治性前列腺癌细胞增殖的影响46-48
• 4.5 番茄红素对激素难治性前列腺癌细胞增殖的影响48-49
• 4.6 番茄红素对激素难治性前列腺癌相关通路关键蛋的影响49-51
• 4.6.1 番茄红素对LNCa P-HR细胞AKT、P-AKT蛋白表达的影响49-50
• 4.6.2 番茄红素对LNCa P-HR细胞ERK蛋白表达的影响50
• 4.6.3 番茄红素对LNCa P-HR细胞P38蛋白表达的影响50-51
• 第5章 讨论51-54
• 第6章 结论54-55
• 参考文献55-59
• 致谢59

【参考文献】

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本文编号：724118